青島海域鮑魚內生真菌代謝產物活性篩選探究

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(青島理工大學 環境與市政工程學院，山東 青島 266033)

從開放實驗出發，作為課堂教學的有效補充，帶領學生探究海洋內生真菌的分離純化實驗操作[1]，既可以鍛煉學生微生物實驗技術中的無菌操作、菌種的分離純化過程，又可以通過發酵條件的優化培養對海洋真菌的次級代謝產物進行初步的研究，使學生進一步了解環境微生物中真菌發酵條件的調控和次級代謝產物的應用-環境微生物資源化。本實驗對于海洋內生真菌的優化培養衡量標準主要從真菌次級代謝產物的質量和抑菌活性兩個方面展開：真菌次級代謝產物的質量主要是分別對真菌培養液和菌絲體進行有機相萃取，然后蒸干稱重；抑菌活性有多種試驗方法[2-4]，本實驗主要是對4株細菌和5株農業病原真菌采用濾紙片擴散法[5-6]進行篩選研究。

1 實驗過程

1.1 實驗儀器

菌種分離與純化用：無菌操作箱，酒精燈，接種環，9cm平板，無菌棉，手術刀、鑷子、打孔器等。

菌種優化培養用：旋轉蒸發儀，分液漏斗，分析天平等；所用試劑均為國產分析純試劑。

1.2 實驗試劑的配置

菌種分離與純化用PDA培養基[7]，消毒酒精(70%～75%的無水乙醇)

1.3 海洋內生真菌分離純化

樣品的采集與預處理：青島第二海水浴場附近的低潮間帶礁石上采集到一只鮑魚(圖1)。

圖1 青島海域鮑魚Fig.1 Abalone from Qingdao Coastline

菌種分離純化方法：主要采取組織分離法。先用無菌海水洗凈鮑魚表面，再用消毒酒精消毒30s左右，然后用無菌海水淋洗組織3～5次，最后用無菌吸水紙將生物表面的水吸干；接著將鮑魚放在無菌玻璃平板上，用無菌手術刀切開鮑魚組織，逐塊放在培養皿內，注意鮑魚組織切面與培養基接觸或直接插入培養基中，然后置于培養箱中倒置培養。待長出真菌菌落以后，使用劃線法[8]分離純化菌種。

1.4 海洋內生真菌優化培養

使用4種不同的培養基[9](改良PDB、改良GPYM、MH1以及固體RICE培養基)對生長形貌奇特的A1菌株進行優化培養，發酵體積每瓶約400mL。

1.5 粗提物的獲得

A1內生真菌靜置發酵14d和28d后，用乙酸乙酯滅菌，2d后發酵液用乙酸乙酯3次以上萃取，使用旋轉蒸發儀蒸干，獲得乙酸乙酯相浸膏；菌絲體晾干破碎后用80%丙酮-水萃取3次以上，旋蒸后得到丙酮相浸膏。稱重，即為A1內生真菌的次級代謝產物質量。

1.6 粗提物的抑菌活性

挑取適量A1菌株優化培養各浸膏，以二甲亞砜配置成200 mg·mL-1的溶液，分別對4株細菌和5株農業病原真菌以濾紙片擴散法進行抑菌活性實驗[10]，每張濾紙片載樣量1mg。細菌、真菌陽性對照分別為氯霉素、兩性霉素B。

4株細菌中包括3株桿菌(枯草芽孢桿菌B.S.、蘇云金芽孢桿菌B.T.、大腸埃希氏桿菌E.C.)和1株球菌(金黃色葡萄球菌S.A.)，5株農業病原菌包括白菜黑斑(BCHB)、棉花枯萎(MHKW)、小麥赤霉(XMCM)、小麥全蝕(XMQS)以及柑橘炭疽(GJTJ)病菌。

2 實驗結果與分析

2.1 鮑魚組織中內生真菌的分離純化結果

48h后發現鮑魚各切面處逐漸有新的菌落出現，使用劃線法共純化出4株新生內生真菌，命名為A1、A2、A3和A4，詳見圖2。

A1菌株：生長初期有白色菌絲體，隨著時間的延長，呈現青綠色菌落，邊緣以及背面均為黃色。

A2菌株：生長初期亦呈白色菌絲，一段時間后中間菌絲漸變為綠色，最后兩種顏色菌絲并存，蔓延至整個培養基平板，呈現“地毯狀”，背面呈現綠色。

A3菌株：菌絲初期為白色，后逐漸變為淺綠色，呈粉末狀向周邊蔓延。

A4菌株：菌落呈現白色絮狀，疏松，背面菌落微紅。

圖2 從鮑魚組織中分離純化出的4株內生真菌Fig.2 4 strains of endophytic fungi isolated and purified from abalone

2.2 優化培養實驗結果

2.2.1 次級代謝產物生產力篩選

由圖3可以發現，對于4種不同的培養基來說，發酵液中代謝產物量均多于菌絲體中的，初步推測胞外代謝可能強于胞內代謝；而對于固體RICE培養基來說，產物量最大。一般說來，為了獲得較大次級代謝產物量，靜置發酵時間最好是28d。

圖3 A1菌株次級代謝產物質量Fig.3 quality of A1 strain secondary metabolite

2.2.2 次級代謝產物抑菌活性篩選

對4株細菌抑菌活性篩選結果發現，A1菌株的PDB培養基對枯草芽孢桿菌(B.S.)有著較專一的抑菌活性，抑菌圈為18mm(陽性對照為24mm)；MH1培養基對金黃色葡萄球菌(S.A.)和大腸埃希氏桿菌(E.C.)有較好的抑菌活性，抑菌圈分別為17m(陽性對照為27mm)和21mm(陽性對照為29mm)；固體RICE培養基的粗提物對枯草芽孢桿菌(B.S.)和大腸埃希氏桿菌(E.C.)抑菌活性最好，抑菌圈分別為22mm和25mm。

對5株農業病原真菌篩選結果可以看出，4種不同的培養基粗提物均對白菜黑斑病菌有著較好的抑制作用，抑菌圈大約在15～18mm不等(陽性對照為22mm)，對小麥赤霉病菌抑制作用稍弱，抑菌圈在10～14mm(陽性對照為24mm)，其中仍然以RICE培養基的抑菌活性較高。

綜上所述，學生通過海邊采樣、菌種分離純化，從鮑魚中分離純化出4株內生真菌；由于受時間和實驗場地的限制，選擇長勢茂盛、形態奇特的菌株A1做優化培養，結果發現其固體RICE培養基代謝產物量較大，抑菌活性也優于其他培養基，可以作為后續深入研究對象，以期發現高抑菌活性組分，為綠色環保農藥研發提供有力的實驗基礎。

3 討論

通過本次開放實驗，學生們在初步科研訓練的基礎上，既擴充了環境微生物實驗技術，也進一步了解了海洋內生真菌的特殊分離純化操作方法，同時又對微生物中真菌的優化培養做了進一步探討，還綜合熟練掌握了化學一些實驗操作技術，比如：萃取以及分液，旋轉蒸發儀的使用等。在開放試驗過程中，集學生文獻查閱、歸納總結、方案設計與討論、規劃每一步實驗操作于一體，使參與學生既受到了良好的科研訓練，擴大了學生知識面，也為學生的科技創新增加了新的思路，有利于應用型人才的培養。