厚樸正丁醇提取部位藥效活性及咽喉刺激性研究

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(1.武漢市第八醫(yī)院,湖北 武漢 430010;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢 430065;3.武漢華夏理工學(xué)院,湖北 武漢 430223 )

厚樸為木蘭科植物厚樸(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.)或凹葉厚樸(Magnolia officinalis Rehd.et wils.var.biloba Rehd.et Wils.)的干燥干皮、根皮及枝皮[1]。味苦、辛，性溫，具有燥濕消痰，下氣除滿的功效，是臨床常用中藥。厚樸生品峻烈，刺激咽喉，姜炙厚樸可達(dá)到減小咽喉刺激性，增強(qiáng)寬中和胃的功效，故臨床上一般用姜炙品而不用其生品[2-3]。厚樸主要化學(xué)成分為木脂素類、揮發(fā)油類、生物堿成分[4-5]，目前研究較多的集中在炮制前后有效成分的含量變化及乙酸乙酯、石油醚等弱極性部[6]的研究上，鮮有對厚樸正丁醇提取部位成分的藥效活性及咽喉刺激性的研究。正丁醇極性跨度較大，能提取較多成分。本文旨在用前期優(yōu)選的提取方法，制備厚樸正丁醇提取部位樣品，對該部位成分進(jìn)行咽喉刺激性和胃腸功能影響研究，綜合探討炮制前后正丁醇部位藥效活性及刺激性成分的變化，以期為姜制厚樸炮制機(jī)理研究提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

TGL-16gR飛鴿高速冷凍離心機(jī)(飛鴿儀器) ,HH6003放射性免疫分析儀((北京核海高技術(shù)開發(fā)公司)，胃泌素放射免疫分析試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)。

1.2 試藥與實(shí)驗(yàn)材料

凈厚樸、姜厚樸(厚樸采自陜西商洛，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)張林壁教授鑒定為木蘭科植物厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils.的干皮、根皮和枝皮，由劉艷菊教授按照炮制規(guī)范制備樣品)，凈厚樸、姜厚樸正丁醇提取部位(自制，浸膏得率分別為3.5%、4.3%)，聯(lián)邦止咳露(深圳致君制藥有限公司，批號：130612)、 嗎丁啉(西安楊森制藥有限公司,批號:131030209)、鹽酸雷尼替丁膠囊(江西匯仁藥業(yè)有限公司，批號：1310024)、活性炭末、阿拉伯膠、吐溫-80(均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)。

根據(jù)《中國藥典》2010年版記載，厚樸飲片入藥劑量為3～9g·d-1[1]，本實(shí)驗(yàn)中以9g作為成人每天用藥劑量。嗎丁啉成人劑量為150mg·d-1，成人體重以60kg計(jì)，小鼠以20g計(jì)，小鼠的給藥劑量設(shè)為低、中、高三種劑量，分別為成人最高劑量的1、2、3倍。

1.3 動(dòng)物

SPF級健康昆明種小鼠，雌雄各半，體重20±2g,購于武漢市疾病防控中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK鄂2004-0015。

1.4 藥液的制備

供試品溶液的制備 低、中、高三種劑量分別為成人最高劑量的1、2、3倍。分別稱取3種劑量凈厚樸、姜厚樸正丁醇部位提取物，用溶劑溶解，制備成含凈厚樸、姜厚樸的低、中、高三個(gè)濃度的溶液，備用。

聯(lián)邦止咳露溶液的制備，取聯(lián)邦止咳露(磷酸可待因)適量 ,加蒸餾水適量,配制成濃度約為0.6g·L-1。

嗎丁琳試劑的制備 取嗎丁琳(多潘立酮片)數(shù)片，置研缽內(nèi)，研成細(xì)粉，然后加入蒸餾水,攪拌均勻，配置成1.75g·L-1的溶液,備用。

鹽酸雷尼替丁溶液的制備 取鹽酸雷尼替丁膠囊數(shù)粒。除去外殼，加入蒸餾水適量，攪拌均勻,配制成2.275g·L-1的溶液，備用。

炭末糊的制備 分別取阿拉伯膠1g、活性炭粉末2g，慢慢加入20mL的蒸餾水，一起慢慢研磨，至完全混均，轉(zhuǎn)移到燒杯中，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 咽喉刺激性研究

2.1.1 供試品溶液的制備

分別稱取3種劑量凈厚樸、姜厚樸正丁醇部位提取物，用雙蒸水溶解，制備成含凈厚樸13.1g·L-1、19.65g·L-1、26.2g·L-1，含姜厚樸16.1g·L-1、24.15g·L-1、32.2g·L-1的低、中、高三個(gè)濃度的溶液，備用。

2.1.2 動(dòng)物與分組

小鼠80只，雌雄各半，體重為20(±2)g，隨機(jī)分為8組，每組10只，①陰性組(0.9%生理鹽水)，②嗎丁啉組(0.045g·kg-1)，③～⑤凈厚樸正丁醇低、中、高劑量組(0.0655、0.0982、0.131g·kg-1),⑥～⑧姜厚樸正丁醇低、中、高劑量組(0.0805、0.121、0.161g·kg-1)低、中、高三個(gè)濃度的溶液，備用。

2.1.3 咽喉刺激性實(shí)驗(yàn)

各組小鼠每天ig給藥2次，每次0.4mL，連續(xù)3 d，最后1次給藥后30min，將小鼠放入容積500mL的玻璃鐘罩內(nèi)，通過空氣壓縮機(jī)連接玻璃噴霧頭，以適當(dāng)恒壓將氨水(25%～28%氫氧化銨)均勻地噴入鐘罩內(nèi)，持續(xù)5s，觀察和記錄小白鼠咳嗽潛伏期及3min內(nèi)的咳嗽次數(shù)[2]。

2.1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對各組的咳嗽潛伏期和3min內(nèi)咳嗽次數(shù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見表1。

表1 凈、姜厚樸正丁醇部位對氨水致小鼠咳嗽的影響(x±s，n=10)Table 1 The effect of mice concentrated ammonia induced cough model on Magnolia officinalis N-butanol part is before and after processing(x±s，n=10)

備注：與陰性組比較1)P<0.01，與姜厚樸對應(yīng)劑量組比較2)P<0.05。

與陰性組對比，聯(lián)邦止咳露組及姜炙厚樸高、中、低劑量組均能顯著延長小鼠咳嗽潛伏期，并減少咳嗽次數(shù)(P<0.01)。凈厚樸組對濃氨所致小鼠咳嗽無顯著性差異，但高、中、低劑量組均能一定程度延長小鼠咳嗽潛伏期及減少咳嗽次數(shù)。 姜厚樸較凈厚樸更明顯的延長小鼠咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)(P<0.05)。

2.2 胃腸動(dòng)力實(shí)驗(yàn)

2.2.1 供試品溶液的制備

分別稱取3種劑量凈厚樸、姜厚樸正丁醇部位提取物，用雙蒸水溶解，制備成含凈厚樸3.238g·L-1、6.475g·L-1、9.712g·L-1，含姜厚樸3.978g·L-1、7.955g·L-1、11.932g·L-1的低、中、高三個(gè)濃度的溶液，備用。

2.2.2 動(dòng)物及分組

小鼠80只,雌雄各半，隨機(jī)分為8組，每組10只，①陰性組(0.9%生理鹽水)，②嗎丁啉組(0.035g·kg-1)，③～⑤凈厚樸正丁醇低、中、高劑量組(1.85、3.70、5.55g·kg-1),⑥～⑧姜厚樸正丁醇低、中、高劑量組(1.85、3.70、5.55g·kg-1)。

2.2.3 小腸推進(jìn)率的測定

各組小鼠每天ig給藥1次，每次0.4mL，連續(xù)3d。末次給藥前18h禁食不禁水，最后1次給藥1h后，小鼠ig給予黑色炭末糊0.4mL，20min后脫頸椎處死小鼠，迅速眼球取血，置EP管備用[7-8]。

小心開腹，迅速取出小腸,輕輕剝離腸系膜后將小腸拉直，測量幽門至回盲部的小腸全長及幽門至黑色半固體糊前沿的距離，計(jì)算小腸推進(jìn)率。

2.2.4 血清胃泌素的測定

將上述待用血液于4～5℃ 3500r·min-1離心10min分離血清，用放射免疫法測定血清中胃泌素含量(按放射性免疫試劑盒方法操作)。

2.2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

用SpSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。結(jié)果見表2。

表2 凈厚樸、姜厚樸正丁醇提取部位對小鼠小腸推進(jìn)率及胃泌素水平的影響 (x±s,n=10)Table2 The effect of n-butanol extract part in Jing Magnolia officinalis and Jiang Magnolia officinalis on the small intestine promotion rate and the serum gastrin level in mice (x±s,n=10)

注：與陰性組比較 ,1)P<0.05，2)P<0.01。

(1)小腸推進(jìn)率試驗(yàn)結(jié)果顯示，各劑量給藥組與陰性組比較，小腸推進(jìn)率效果顯著增加(P<0.05)，其中凈厚樸低、高兩個(gè)劑量組、姜厚樸低劑量組作用更明顯(P<0.01)。高劑量的姜厚樸在小腸推進(jìn)率上明顯優(yōu)于對應(yīng)劑量凈厚樸，且高劑量存在顯著性差異。

(2)血清胃泌素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 與陰性組比較，嗎丁啉陽性組、姜厚樸低、中、高各劑量組都能顯著促進(jìn)小鼠胃泌素的釋放，提高胃腸消化功能，具有顯著性差異(P<0.05)。凈厚樸各劑量組對陰性組雖沒有顯著性差異，但具有不同程度的促進(jìn)分泌作用，姜厚樸組藥效高劑量>中劑量>低劑量，姜厚樸各劑量組的效果優(yōu)于同劑量的凈厚樸組。

2.3 HCl性胃潰瘍實(shí)驗(yàn)

2.3.1 供試品溶液的制備

分別稱取3種劑量凈厚樸、姜厚樸正丁醇部位提取物，用2%吐溫-80的雙蒸水溶解，制備成含凈厚樸2.935g·L-1、5.87g·L-1、8.805g·L-1，含姜厚樸3.978g·L-1、7.955g·L-1、11.932g·L-1的低、中、高三個(gè)濃度的溶液，備用。

2.3.2 動(dòng)物與分組

小鼠64只，雌雄各半，體重為20(±2)g，隨機(jī)分成8組，每組8只，①陰性組(0.9%生理鹽水)，②嗎丁啉組(0.045g·kg-1)，③～⑤凈厚樸正丁醇低、中、高劑量組(2.389、4.777、7.165g·kg-1),⑥～⑧姜厚樸正丁醇低、中、高劑量組(2.935，5.87，8.805g·kg-1)低、中、高三個(gè)濃度的溶液，備用。

2.3.3 胃潰瘍試驗(yàn)的測定

各組小鼠每天ig給藥1次，每次0.4mL，連續(xù)3d ，末次給藥前24h禁食不禁水，最后1次給藥1h后，小鼠ig給予0.6mol·mL-1鹽酸，1h后眼球取血后脫頸椎處死，血液離心取血清待用[9]。

小心解剖出胃，用剪刀沿胃大彎剪開，用生理鹽水清洗，應(yīng)激性胃潰瘍在胃部沿著血管走行分布，表面覆蓋凝血，用濾紙擦拭凝血后鏡檢，以深褐色條索狀潰瘍的長度總和(mm)表示條狀損害，計(jì)算潰瘍抑制百分率(%)。

2.3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

表3 凈厚樸、姜厚樸正丁醇提取部位對鹽酸胃潰瘍潰瘍指數(shù)及潰瘍抑制率比較(x±s,n=8)Table3 Comparison of the ulcer index and ulcer inhibitory rate of n-butanol extract part in Jing Magnolia officinalis and Jiang Magnolia officinalis (x±s,n=8)

備注：與陰性組比較1)P<0.01，與姜厚樸對應(yīng)劑量組比較;2)P<0.05。

與陰性組比較，各給藥組潰瘍指數(shù)均顯著性降低，具有顯著性差異(P<0.01)。說明各給藥組對小鼠實(shí)驗(yàn)性HCL潰瘍均有一定抑制功能。姜厚樸較凈厚樸對潰瘍抑制率具有顯著性提高，對應(yīng)劑量的效果具有顯著性差異(P<0.05)。

3 討論

(1)厚樸生品峻烈，刺激咽喉，姜炙厚樸可達(dá)到減小咽喉刺激性，增強(qiáng)寬中和胃的功效。研究結(jié)果表明，厚樸姜炙后其正丁醇提取部位能顯著延長小鼠咳嗽潛伏期和減少咳嗽次數(shù)，且效果顯著優(yōu)于模型組，凈厚樸正丁醇提取部位作用較弱，姜厚樸正丁醇提取部位較凈厚樸的刺激性明顯減低，厚樸的刺激性成分，有人認(rèn)為并非其揮發(fā)油[5]，本實(shí)驗(yàn)證明，刺激性的降低可能與厚樸正丁醇部位某些生物堿成分的減少有關(guān)，故降低刺激機(jī)理尚待進(jìn)一步研究 。

(2)通過研究，厚樸姜炙前后其正丁醇提取部位對促進(jìn)小腸推進(jìn)率、胃泌素釋放和潰瘍抑制率的作用，均優(yōu)于模型組，說明厚樸飲片正丁醇部位對小腸胃腸功能均有促進(jìn)作用。

(3)研究發(fā)現(xiàn)，各給藥組對血清胃泌素含量影響不顯著，只有姜厚樸的各劑量組與陰性對照組存在顯著性差異，姜厚樸各劑量組的效果優(yōu)于同劑量的凈厚樸組。這可能與胃腸運(yùn)動(dòng)受胃泌素、胃動(dòng)素、腸肽、P物質(zhì)有關(guān)[10-11]。

(4)在促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)功能上，高劑量的姜厚樸明顯優(yōu)于對應(yīng)劑量上凈厚樸，且高劑量存在顯著性差異，但與陽性組對照，無顯著性差異。在潰瘍抑制率上，姜厚樸較凈厚樸對潰瘍抑制率具有顯著性提高。

(5)對比厚樸姜炙前后不同提取部位的藥效學(xué)研究中，正丁醇提取部位與乙酸乙酯提取部位[6]對潰瘍抑制率具有一致性，對小腸推進(jìn)率上正丁醇部位優(yōu)于乙酸乙酯部位，這可能與正丁醇部位成分的極性有關(guān)，為今后就正丁醇部位成分研究，以及進(jìn)一步闡明厚樸炮制機(jī)理奠定基礎(chǔ)。