固體復合香辛料中罌粟殼質控樣的制備

袁 磊， 李 濤， 林 芳， 王一欣， 裴小龍

(陜西省食品藥品監督檢驗研究院， 陜西 西安 710065)

隨著人們生活水平的提高，簡單的調味料已不能滿足人們的生活需求，復合香辛料在食品中的應用越來越廣泛,由于它是由多種香辛料構成[1]，使用方便，且在應用時都有固定的配方，具有定量的可操作性，對于餐飲的規模化生產，特別在烹飪加工中菜品的質量穩定與標準化具有重要意義[2]。然而不法分子為了謀取利益，提高食品的口感，將罌粟殼或其浸提物添加到香辛料、調味料、火鍋料中使食物味道鮮美，罌粟殼含多種生物堿類物質，如嗎啡、可待因、那可丁、罌粟堿、蒂巴因等，長期食用易使人體產生依賴性而造成癮癖，導致慢性中毒，出現發冷、出虛汗、乏力、面黃肌瘦、犯困等癥狀，嚴重時可能對神經系統、消化系統造成損害，引起精神失常，出現幻覺，有時甚至會導致呼吸停止而死亡[3-6]。截至目前，衛計委先后公布了6批食品非法添加物質目錄，罌粟殼被列入了第一批食品非法添加物質目錄中[7]。

目前檢測香辛料中罌粟殼生物堿類物質的方法有液相色譜法[8]、液相色譜-串聯質譜法[9-11]、氣相色譜-質譜法[12-13]、熒光定量PCR法[14]，國家標準方法有DB31 2010—2012《食品安全地方標準 火鍋食品中罌粟堿、嗎啡、那可丁、可待因和蒂巴因的測定 液相色譜-串聯質譜法》，對罌粟殼生物堿類物質快速檢測方法(膠體金法、電子鼻技術)也有相關應用[15-16]，然而在對生物堿類物質的檢測過程中，基體的干擾使得在分析檢測時不能簡單地采用純品標準物質來檢測校準或質量控制，需要一定帶基體的質控樣來協助檢測才能保證檢測結果的準確性或滿足要求，目前對含有罌粟殼的香辛料質控樣的制備技術或相近技術無公開文獻介紹，因此制備相關質控樣對于檢測方法的開發、檢測過程的質量控制、實驗室能力驗證、實驗室間比對及在快速檢測領域用于快檢過程質量控制等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁、D3-嗎啡、D3-可待因對照品，中國藥品生物制品檢定所；甲醇、乙腈、甲酸，色譜純，德國Merck公司；甲酸銨，色譜純，韓國Duksan公司；鹽酸、無水硫酸鎂、無水乙酸鈉，分析純，國藥集團；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)(粒度40～70 μm)、C18填料(粒徑40～50 μm)，天津博納艾杰爾公司；小茴香、八角茴香、桂皮、肉蔻、花椒、白胡椒、干姜、陳皮、丁香、孜然、甘草均為市售。

1.2 儀器與設備

AB Qtrap 5500型液相色譜-質譜聯用儀(配有電噴霧離子源及數據處理系統)，美國SCIEX公司；RWBX-08S型箱式智能微波干燥機，南京蘇瑞公司；SYH-5型三維混合儀，常州海堯干燥設備有限公司；BJ-800A型粉碎機，上海拜杰公司；IS075型直線電子加速器，同方威視公司；LYNX4000型離心機，美國Thermo公司；KQ-500DE型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；MS3型渦旋振蕩器，德國IKA公司。

1.3 實驗方法

1.3.1含有罌粟殼的固體復合香辛料質控樣的制備

本研究建立了一種含有罌粟殼的固體復合香辛料質控樣的制備方法，制備流程見圖1，該方法簡單，可操作性強、質控樣均勻性良好，穩定性強，可在常溫下長期保存。

圖1 含有罌粟殼的固體復合香辛料質控樣制備流程Fig.1 Preparation flow diagram of quality control samples of solid compound spices containing poppy shell

1.3.1.1 基質材料的制備

根據市售香辛料、調味料的配方，取用新鮮干燥，具有本身特有氣味和無霉變的原料小茴香、八角茴香、桂皮、肉蔻、花椒(去籽)、白胡椒、干姜、陳皮、丁香、孜然、甘草，除去雜質，進行微波干燥，干燥時微波功率0.5 kW，1 kg物料干燥5 min。干燥后按GB 5009.3—2010《食品安全國家標準 食品中水分的測定》檢測水分含量，使干燥后的基質材料水分質量分數控制在5%以下。將干燥好的基質材料按一定比例混合，根據市售香辛料、調味料的混合比例以及最大限度的覆蓋所有基質材料，調整基質材料用量及比例見表1，混合后粉碎，過40目篩，將制備好的基質材料按1.3.2節方法進行檢驗，以確保其不含罌粟殼生物堿類物質(嗎啡、可待因、蒂巴因、罌粟堿、那可丁)。

表1 基質材料用量及比例 Tab． 1 Amounts and proportions of different kinds of materials g

1.3.1.2 罌粟殼的處理

取用一定量的罌粟殼，除去雜質后進行微波干燥，1 kg基質材料，微波功率0.5 kW，干燥時間為5 min。使干燥后的罌粟殼水分質量分數控制在5%以下，粉碎，粉碎后過40目篩，依據1.3.2節方法對制備好的材料進行生物堿類物質的含量檢測，檢測結果為嗎啡質量分數為0.09%、可待因質量分數為0.27%、蒂巴因質量分數為0.27%、罌粟堿質量分數為0.04%、那可丁質量分數為0.03%。

1.3.1.3 一次混合

根據罌粟殼中生物堿的含量，稱量3 g罌粟殼粉末，3 kg基質材料，將m(基質材料)與m(罌粟殼粉末)按5∶1比例進行初次混合，混合均勻后的樣品與基質材料m∶m=1∶10的比例再次混合，混合均勻后的樣品與剩余的基質材料混合，根據混合后質控樣的總量按質量分數0.5%的比例加入SiO2抗結劑，混合均勻。

對混合方法進行了實驗研究，在混合時m(樣品)與m(基質材料)的最大混合比例為1∶10，三維混合法，40 r/min，混合2 h。

1.3.1.4 二次混合

對混合均勻的質控樣進行二次干燥，使干燥后的基體粉末水分質量分數控制在5%以下，干燥后過40目篩，進行二次混合，三維混合法，40 r/min，混合2 h。

1.3.1.5 分裝

西林瓶充氮包裝，每瓶裝10 g，共200瓶。

1.3.1.6 殺菌

采用輻照殺菌法對樣品進行殺菌，殺菌條件為：輻照源60Co，輻照劑量7 kGy。

1.3.2質控樣中生物堿類物質的檢測

1.3.2.1 樣品前處理方法

按照DB 31 2010—2012方法檢測生物堿類物質。采用0.1 mol/L鹽酸溶液與乙腈超聲提取，加入無水硫酸鎂與無水醋酸鈉離心分層，上清液經PSA、無水硫酸鎂、C18粉末凈化后，液相色譜-串聯質譜法測定，罌粟堿、那可丁、蒂巴因采用外標法定量，嗎啡、可待因采用內標法定量。

1.3.2.2 液相色譜條件

Agilent ZORBAX SB-Aq(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)型色譜柱，柱溫35 ℃，流速0.2 mL/min，進樣量5 μL，流動相A為甲醇，流動相B為含體積分數為0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨溶液，梯度洗脫，洗脫時間6 min,梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫條件

1.3.2.3 質譜條件

電離模式ESI+,掃描方式MRM多反應監測,毛細管電壓5 500 V,脫溶劑氣溫度550 ℃,噴霧器流速55PSI,定性、定量離子對和碰撞電壓(CE)及去簇電壓(DP)見表3。

表3 生物堿類化合物的質譜參數

*為定量離子，其他為定性離子。

1.3.3樣品均勻性檢驗

按照GB/T 15000.5—1994對質控樣進行均勻性實驗，均勻性檢驗的總體樣本數共200個，順序編號后隨機抽取15個樣品進行均勻性檢驗，每個樣品在重復條件下檢測3次為一組，共15組數據，采用單因素方差分析方法對數據進行統計分析，計算組內的均方差與組間均方差，以及各自的自由度，顯著性水平α，按方差檢驗給定的計算方法計算統計量F，通過GB/T 15000.5—1994附錄B，找出臨界值F，進行比較，做出結論。

1.3.4樣品穩定性檢驗

依據GB/T 15000.3—2008，質控樣在進行定值時，需考慮長期穩定性(有效期)與短期穩定性(運輸條件下參考物質的穩定性)，因該參考物質為常溫保存，可不考慮短期穩定性，只考察長期穩定性。實驗方法為在對質控樣分裝后2、4、6、8、10、12、14個月考察穩定性，每個時間點隨機抽取3個樣品，每個樣品平行測定2次，以3瓶樣品的總平均值為該時間穩定性檢驗結果，0個月檢驗結果使用均勻性檢驗結果的總平均值；檢測方法與均勻性研究檢驗方法一致。

數據統計方法依據GB/T 15000.3—2008采用線性擬合方程模型為穩定性研究基本模型，可表示為Y=β0+β1X+ε，其中X為時間，Y為參考物質的特性量值，β0、β1為回歸系數，ε為隨機誤差分量。對于穩定性較好的樣品，β0為測定得到的值，β1期望值為0，X與Y之間的線性關系可用t檢驗法，具體方法如下。

直線斜率的計算式：

(1)

截距的計算式：

(2)

直線上點標準偏差的計算式：

(3)

與斜率相關的不確定度的計算式：

(4)

1.3.5定值與不確定性評估

質控樣的定值由10個通過資質認定的實驗室采用DB 31 2010—2012方法協作完成，檢測數據經柯克倫檢驗，格拉布斯檢驗后取平均值進行定值。

由于本批質控樣采用的定值方式是由10家實驗室協同定值的方案，因此不確定度主要包括：短期穩定性引入的不確定度、測定值的標準不確定度、瓶間差異引入的不確定度與長期穩定性引入的不確定度。本批參考物質定值方式是協同定值，短期穩定性引入的不確定度已包含在實驗室的檢測值中，故可忽略不計，最終的不確定度由以上不確定度的合成不確定度表示。

2 結果與分析

2.1 輻照殺菌條件的優化

采用60Co-γ對包裝好的質控樣進行殺菌[17-18]，取33份獨立包裝的樣本，分別以0～10 kGy的輻照劑量進行輻照，對輻照后的樣本取樣進行微生物檢測以評價滅菌效果，細菌總數隨輻照劑量的變化趨勢如圖2，由圖2可以看出，當輻照劑量達到6 kGy時，菌落總數達到無檢出的水平(<10 CFU/g),因此，輻照殺菌可以實現質控樣的滅菌，為保證充分滅菌，最終選擇以7 kGy對質控樣進行輻照滅菌。

圖2 輻照對質控樣中菌落總數的影響Fig.2 Effects of irradiation on total number of colonies in quality control samples

為驗證60Co-γ輻照前后對質控樣中生物堿類物質的影響，對輻照前后樣本中的生物堿類物質進行檢測，5種生物堿類物質隨輻照劑量的變化如圖3。由圖3可知，輻照前后生物堿類物質的含量差異不明顯，因此60Co-γ輻照可以達到滅菌的效果，有效的延長了保質期。

圖3 輻照對質控樣中生物堿類物質的影響Fig.3 Effects of irradiation on alkaloids in quality control samples

2.2 樣品均勻性檢驗

按照DB 31 2010—2012方法對樣品進行檢測，采用單因素方差分析法對數據進行統計分析，檢驗樣品的均勻性，結果見表4，組間自由度為14，組內自由度為30，查GB/T 15000.5—1994附錄B，F0.05(14，30)=2.31，由表可以看出5個組分的F值均小于F0.05(14，30)，表明樣品間不存在顯著性差異，證明所得的樣本是均勻的。

2.3 樣品穩定性檢驗

按照1.3.4的方法對檢測結果進行數據統計分析，結果見表5，查GB/T 15000.5—1994附錄F，得自由度為6，置信水平為0.95的t因子為2.48，由計算結果可以看出，|b1|

表4 固體復合香辛料中5種生物堿的均勻性檢驗結果

表5 固體復合香辛料質控樣中5種生物堿的穩定性檢驗結果

2.4 質控樣的定值

質控樣的定值由10個認可實驗室協作完成，采用的方法為DB 31 2010—2012，檢測數據見表6，對所有數據進行統計分析。

表6 10個實驗室質控樣定值結果

2.4.1柯克倫檢驗

先利用柯克倫檢驗，對其標準差的最大值進行檢驗，查看是否有離群數據，要求所有標準差都是在重復條件下獲得，且由相同數目計算結果得出。

柯克倫檢驗統計量計算式為：

(5)

將計算結果與臨界值作比較，C≤C5%，表示結果為正確值；C5%≤C≤C1%，表示結果為可疑值，需做進一步分析；C≥C1%，表示結果為離群值，需將該結果剔除，其他數據作進一步統計分析。協同定值的實驗室數P=10，每個實驗室測定數n=3，查柯克倫檢驗5%的臨界值為0.445，1%的臨界值為0.536。

對于可待因，2號實驗室與4號實驗室的標準偏差最大,計算C=0.184,對于蒂巴因，5號實驗室的標準偏差最大，計算C=0.188，對于嗎啡，5號實驗室的標準偏差最大，計算C=0.188，對于罌粟堿，6號實驗室的標準偏差最大，計算C=0.176，對于那可丁，3號實驗室的標準偏差最大，計算C=0.236。由以上計算結果可以看出，5個指標的檢驗統計量C≤C5%，則10個實驗室的檢驗結果全部通過柯克倫檢驗。

2.4.2對10個實驗室的檢測均值進行單值格拉布斯檢驗

實驗室數P=10，查格拉布速檢驗的臨界值表，G5%的臨界值為2.290，G1%的臨界值為2.482，經計算5個指標的G1

2.4.3對10個實驗室的檢測均值進行雙值格拉布斯檢驗

雙格拉布斯檢驗量G2P的計算式為：

(6)

(7)

協同定值的實驗室數P=10，查格拉布速檢驗的臨界值表，G5%的臨界值為0.186 4，G1%的臨界值為0.115 0。經計算，5個指標的G2≥G5%，所有數據均為正確值，均可保留并參與定值。

2.5 不確定度評估

不確定度的評定參考GB/T 15000.3—2008，本批質控樣采用的定值方式是由10家實驗室協同定值的方案，引入的不確定度主要包括測定值的標準不確定度μchar、瓶間差異引入的不確定度μbb、長期穩定性引入的不確定度μlts、短期穩定性引入的不確定度μsts，最終的不確定度由其合成不確定度表示。

2.5.1測定值的標準不確定度

檢測數據經柯克倫檢驗與格拉布斯檢驗分析，所有數據均可保留并參與最終定值，參考物質的定值即為各實驗室平均值的均值，與平均值有關的合成標準不確定計算式為：

(8)

(9)

2.5.2瓶間差異引入的不確定度

在對質控樣均勻性研究中，瓶間均勻性已被驗證，統計方法采用單因素方差分析，由下列公式計算瓶間差異引入的不確定度μbb。

瓶間方差計算式：

(10)

式(10)中MSamong為組間方差，MSwithin為組內方差，n0為每組實驗個數。

瓶間標準偏差計算式：

(11)

重復性標準偏差計算式：

(12)

由瓶間均勻度引入的不確定度計算式：

(13)

其中P為實驗室個數。

2.5.3長期穩定性引入的不確定度

穩定性數據統計采用線性擬合方程模型，由穩定性研究結果表明，在14個月期間樣品是穩定的，長期穩定性不確定度μlts的計算公式為μlts=Sb×t，由表5計算的Sb帶入公式計算得μlts。

2.5.4合成不確定度

質控樣最終確定標準值由定值的總平均值與不確定度組成，結果為：可待因(907±20.9)μg/kg，蒂巴因(918±18.4)μg/kg，嗎啡(315±16.5)μg/kg，罌粟堿(171±12.6)μg/kg，那可丁(139±15.8)μg/kg。參考物質的穩定性只研究至14個月，則暫定其保質期為14個月，如材料的穩定性得到進一步證明，則有效期還可延長。

表7 質控樣不確定度評估表

3 結 論

本研究建立了一種固體復合香辛料中罌粟殼質控樣的制備方法。在制備過程中采用了微波干燥技術，并控制水分含量在5%以下，該方法干燥條件短，且能很好地保持基質材料和罌粟殼的原始狀態，有利于其粉碎，也能提高后期的混合效率；基體粉末與罌粟殼粉末混合采用三維混合法，該方式使混合的均勻程度達到最大化，效率高；拮抗劑的加入，可以防止質控樣聚集結塊，保持其松散或自由流動，且不影響對生物堿類物質的檢測；采用輻照殺菌，即能殺死微生物，延長保質期，還能保證生物堿類物質不被破壞；定值由10家通過認可的實驗室協作完成，結果量值可靠，均勻性與穩定性良好。利用該方法制備的質控樣用于檢測方法的開發、檢測過程的質量控制、實驗室能力驗證及在快速檢測領域應用等具有重要意義。