鹽析液液萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定奶粉中四環(huán)素類(lèi)抗生素

羅瑞漣

(佛山市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)中心， 廣東 佛山 528225)

四環(huán)素類(lèi)抗生素在畜牧業(yè)中廣泛應(yīng)用[1]，但該類(lèi)抗生素在動(dòng)物源性食品中的過(guò)量殘留會(huì)危害人類(lèi)的健康，如損害肝臟，引起牙黃和腸胃功能紊亂，產(chǎn)生過(guò)敏和抗藥性等[2]。為此，歐盟及我國(guó)均制定了四環(huán)素類(lèi)抗生素單個(gè)或復(fù)合物在動(dòng)物源性食品中的最大殘留限量，為100 μg/kg[3-4]。

奶粉作為嬰幼兒攝取營(yíng)養(yǎng)的重要食品，全世界都十分關(guān)注其安全性。然而，嬰兒配方奶粉中四環(huán)素類(lèi)抗生素的殘留限量還沒(méi)有出臺(tái)相關(guān)的規(guī)定。為此，有必要開(kāi)發(fā)靈敏度高、檢出限盡可能低的測(cè)定嬰兒配方奶粉中四環(huán)素類(lèi)抗生素的方法。目前，奶粉中四環(huán)素類(lèi)抗生素的檢測(cè)方法主要有液相色譜-紫外檢測(cè)法[5]、高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法[6]和超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法[7]。樣品中四環(huán)素類(lèi)抗生素的提取凈化方法主要有固相萃取法和液液萃取法。近年來(lái)，又衍生出了鹽析液液萃取法。這種方法是向樣品溶液和強(qiáng)極性有機(jī)溶劑組成的混合物中加入適當(dāng)?shù)柠}類(lèi)化合物，促使有機(jī)溶劑更好地從混合物中分離出來(lái)[8]。該方法簡(jiǎn)單、快速，在大大減少有機(jī)溶劑使用量的同時(shí)，能夠提高四環(huán)素類(lèi)抗生素這類(lèi)極性化合物的萃取效率。國(guó)內(nèi)外的研究均已將鹽析液液萃取法應(yīng)用在食品檢測(cè)上[8-12]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明該方法對(duì)目標(biāo)化合物的萃取凈化效果較好，操作快速可靠、靈敏度高，有較高的回收率和較低的檢出限，經(jīng)濟(jì)適用性較好。鑒于鹽析輔助液液萃取法的優(yōu)越性，文章率先采用該法來(lái)提取嬰兒配方奶粉中的四環(huán)素類(lèi)抗生素，并結(jié)合超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸四環(huán)素(97.7%)、鹽酸土霉素(97.5%)、鹽酸金霉素(93.0%)、鹽酸強(qiáng)力霉素(98.0%)，購(gòu)于Sigma公司。甲酸、甲醇、乙腈，均為色譜純，購(gòu)于德國(guó)安譜公司。乙酸乙酯、乙腈、十二水合磷酸氫二鈉(磷酸氫二鈉)、一水合檸檬酸(檸檬酸)、乙二胺四乙酸二鈉、硫酸銨、草酸銨，均為分析純，購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠?；菔蠣I(yíng)養(yǎng)品(中國(guó))有限公司嬰兒配方奶粉，購(gòu)于某大型超市。

1.2 儀器與設(shè)備

Quattro Premier XE型超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS)，美國(guó)Waters公司；OA-SYS型水浴氮吹儀，美國(guó)Organomation公司；T-214型電子天平，德國(guó)Sartorius公司；XW-80A型旋渦混合器，上海馳唐電子有限公司；KQ-500VDE型超聲清洗儀，昆山儀器有限公司；SHY-2型振蕩器，常州萬(wàn)合儀器有限公司；TGL-16M型離心機(jī)，上海盧湘儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1溶液配制

Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液：分別稱(chēng)取2.10 g檸檬酸和2.84 g磷酸氫二鈉，分別用水溶解并定容至100 mL，配制成0.1 mol/L的檸檬酸溶液和0.2 mol/L的磷酸氫二鈉溶液；取100 mL檸檬酸溶液與62.5 mL磷酸氫二鈉溶液混合，并加入6.05 g乙二胺四乙酸二鈉，使其溶解，搖勻，必要時(shí)用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH值至4.00±0.05，即得0.1 mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別精確稱(chēng)取4種四環(huán)素類(lèi)抗生素標(biāo)準(zhǔn)品2.5 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃下避光保存。根據(jù)需要用體積分?jǐn)?shù)50%乙腈水溶液逐級(jí)稀釋?zhuān)渲瞥珊线m濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2樣品溶液的制備

稱(chēng)取1 g樣品置于50 mL離心管中，添加1.5 mL Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液，于旋渦混合器上充分混勻后，置于超聲清洗儀中超聲20 min。然后加入3.5 mL乙腈，置于振蕩器上振蕩混勻15 min。隨后加入1.32 g(NH4)2SO4，渦旋混勻后，4 500 r/min離心5 min，上清液N2吹干，溫度低于40 ℃。將殘?jiān)苡? mL 50%乙腈水溶液中，過(guò)0.22 μm PTFE濾膜，濾液待上機(jī)測(cè)定。

1.3.3基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

不含待測(cè)物的樣品按1.3.2節(jié)的方法提取，得到空白基質(zhì)溶液。以空白基質(zhì)溶液作為溶劑配制系列混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，使基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中四環(huán)素類(lèi)抗生素的質(zhì)量濃度分別為1、5、20、50、100 ng/mL。

1.3.4UPLC-MS/MS檢測(cè)條件

1) UPLC條件。色譜柱：Acquity UPLC BEH C18，1.7 μm，100 mm×2.1 mm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流動(dòng)相：A為甲酸水溶液(體積分?jǐn)?shù)0.1%)，B為乙腈(色譜純)；流速：0.2 mL/min；梯度洗脫程序列于表1。

表1 UPLC梯度洗脫程序

2) 質(zhì)譜參數(shù)。電離方式：電噴霧正離子(ESI+)模式；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑溫度：300 ℃；脫溶劑氣流：N2，流速500 L/h；錐孔氣流：N2，流速50 L/h；碰撞氣：氬氣，流速0.12 mL/min；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在調(diào)諧條件下通過(guò)注射器直接進(jìn)樣，分別對(duì)1 μg/mL的各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子和子離子掃描，確定定量和定性離子對(duì)，對(duì)毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能和駐留時(shí)間等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，主要的優(yōu)化參數(shù)見(jiàn)表2。4種四環(huán)素類(lèi)抗生素的總離子色譜圖如圖1。從圖1中可以看出，4種藥物可以在4.5 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速分離檢測(cè)。

2.2 提取和凈化條件的優(yōu)化

2.2.1萃取溶劑對(duì)萃取效果的影響

液液萃取方法中，有機(jī)萃取溶劑的選擇至關(guān)重要。在日常的食品安全檢測(cè)中，常用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮等。實(shí)驗(yàn)選取了乙腈和乙酸乙酯作為研究對(duì)象，按照1.3.2節(jié)的方法處理樣品，通過(guò)目標(biāo)化合物的平均回收率來(lái)評(píng)價(jià)兩者的萃取效果，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2中數(shù)據(jù)可見(jiàn)，采用乙腈作為萃取溶劑時(shí)，4種四環(huán)素類(lèi)抗生素的平均回收率較高，說(shuō)明相比于極性較弱的乙酸乙酯，具有強(qiáng)極性的乙腈萃取含有極性基團(tuán)的四環(huán)素類(lèi)抗生素的效果更好。而且，乙腈還具有沉淀蛋白質(zhì)的能力，能降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高凈化效果。此外，為了考察萃取溶劑的體積對(duì)樣品溶液中目標(biāo)化合物的萃取效率，在5 μg/kg的加標(biāo)水平下使用不同體積的乙腈作為萃取溶劑進(jìn)行萃取實(shí)驗(yàn)，體積變化范圍為2.0～4.0 mL。結(jié)果顯示，隨著乙腈體積的增加，4種四環(huán)素類(lèi)抗生素的平均回收率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)乙腈體積大于3.5 mL時(shí)，4種四環(huán)素類(lèi)抗生素的平均回收率增加不明顯。綜合考慮，以3.5 mL的乙腈作為萃取溶劑。

表2 保留時(shí)間及串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)

*代表定量離子。

圖1 4種四環(huán)素類(lèi)抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 4 tetracyclines mixed standard solution

圖2 不同有機(jī)溶劑的萃取效果Fig.2 Extraction effects of different organic solvents

2.2.2銨鹽對(duì)萃取效果的影響

不同類(lèi)型的銨鹽對(duì)液液萃取過(guò)程中相分離的程度存在一定的影響。銨鹽相比于其他鹽類(lèi)，在電離室能夠輕易揮發(fā)或分解，從而避免對(duì)質(zhì)譜造成損害，是一類(lèi)質(zhì)譜友好的鹽類(lèi)化合物[13]。文章研究了硫酸銨和草酸銨在液液萃取方法中對(duì)相分離程度的影響。從目標(biāo)化合物的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3)可見(jiàn)，硫酸銨在液液萃取過(guò)程中，能更好地促進(jìn)乙腈和水相的分離，從而提高目標(biāo)化合物的萃取效率，而且回收率的重現(xiàn)性也比草酸銨更好。對(duì)于硫酸銨的用量，本文也做了相關(guān)的研究。實(shí)驗(yàn)時(shí)逐步添加鹽的用量至其不能溶解。研究表明，當(dāng)硫酸銨用量小于1.32 g時(shí)，4種四環(huán)素類(lèi)抗生素均獲得了不錯(cuò)的回收率；繼續(xù)增加硫酸銨的用量，目標(biāo)化合物的平均回收率幾乎不再增加，且還有下降的趨勢(shì)；而且觀察加鹽后混合液的分層情況，發(fā)現(xiàn)加鹽量大于1.32 g時(shí)，有部分硫酸銨不能完全溶解，可能此時(shí)硫酸銨在樣品混合液中已經(jīng)達(dá)到飽和。綜上所述，選擇硫酸銨的用量為1.32 g。

圖3 不同類(lèi)型銨鹽對(duì)相分離程度的影響Fig.3 Phase separation effects of different ammonium salts

2.2.3萃取方法對(duì)萃取效果的影響

文章對(duì)比了固相萃取法和鹽析輔助液液萃取法對(duì)目標(biāo)化合物的提取效果。固相萃取法參照GB/T 21317—2007的方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理[14]。采用HLB固相萃取柱凈化，4種四環(huán)素類(lèi)抗生素殘留的回收率明顯偏低，而且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差也偏大(見(jiàn)圖4)。從4種化合物的總離子流圖可以看出，鹽析輔助液液萃取法的凈化效果較好，色譜圖中雜峰較少(見(jiàn)圖5)。原因可能是嬰兒配方奶粉中蛋白質(zhì)含量較高，容易造成固相萃取柱的堵塞，使得目標(biāo)化合物不能完全洗脫，洗脫液中也含有較多雜質(zhì)。也可能是因?yàn)椴煌蔚腍LB固相萃取柱里面的填料質(zhì)量參差不齊，難以保證目標(biāo)化合物獲得穩(wěn)定的回收率。

圖4 不同凈化方法的提取效果Fig.4 Extraction effects of different purification methods

圖5 不同凈化方法的總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of different purification methods

2.3 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、檢出限和加標(biāo)回收率分析

研究基質(zhì)效應(yīng)最常用的方法是相對(duì)響應(yīng)值法，即基質(zhì)效應(yīng)=空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)大于1時(shí)，表明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；反之，則存在基質(zhì)抑制效應(yīng)[15]。分別用奶粉空白提取液和純?nèi)軇┡渲? ng/mL和50 ng/mL 2個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，比較其測(cè)得的響應(yīng)值(峰面積)，從而考察基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，樣品基質(zhì)對(duì)4種四環(huán)素類(lèi)抗生素均有增強(qiáng)效應(yīng)，因此基質(zhì)效應(yīng)不可忽略，應(yīng)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。

實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定1.3.3節(jié)中的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中縱坐標(biāo)Y是每種抗生素定量離子的色譜峰面積，橫坐標(biāo)X是對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(ng/mL)，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，在1～100 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，4種四環(huán)素類(lèi)抗生素的含量與其峰面積均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

表3 4種四環(huán)素類(lèi)抗生素的線性方程和相關(guān)系數(shù)

根據(jù)國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUPAC)對(duì)檢出限的定義，實(shí)驗(yàn)將低濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到陰性嬰兒配方奶粉中，使樣品中標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量比分別為0.5 μg/kg和1 μg/kg，處理方法同1.3.2節(jié)，每個(gè)水平平行測(cè)定6次，計(jì)算各目標(biāo)化合物峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算各個(gè)化合物的檢出限(置信水平P=95%)，最終選取檢出限最低的化合物所對(duì)應(yīng)的結(jié)果作為本方法的檢出限[16]。結(jié)果顯示，這2個(gè)水平的檢出限分別為0.36 μg/kg和0.67 μg/kg。然后，按照1.3.2節(jié)中的方法驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)4種四環(huán)素類(lèi)抗生素與空白奶粉樣品的質(zhì)量比均為0.36 μg/kg時(shí)，在超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀上仍然有響應(yīng)，并且信噪比S/N>3，因此，確定0.36 μg/kg為該方法的檢出限。

以不含目標(biāo)化合物的嬰兒配方奶粉為基質(zhì)，加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使目標(biāo)化合物在樣品中的質(zhì)量比分別為1、5、50 μg/kg，每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定4次，結(jié)果見(jiàn)表4。實(shí)驗(yàn)平均回收率在71.88%～107.13%，方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8%，可以滿足日常檢測(cè)工作的需要。

表4 4種四環(huán)素類(lèi)抗生素加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

3 結(jié) 論

研究了鹽析液液微萃取-超高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)嬰兒配方奶粉中四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素這4種四環(huán)素類(lèi)抗生素的方法。該方法下4種四環(huán)素類(lèi)抗生素在4.5 min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)快速分離檢測(cè)；最低檢出限為0.36 μg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)標(biāo)中固相萃取法的50 μg/kg；質(zhì)量濃度為1～100 ng/mL時(shí)，4種化合物線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均在0.999 0以上；加標(biāo)濃度為1、5、50 μg/kg時(shí)的平均回收率為71.88%～107.13%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于8%，滿足四環(huán)素類(lèi)抗生素常規(guī)檢測(cè)的需要。本方法大大減少了有機(jī)溶劑的用量，簡(jiǎn)單快速、經(jīng)濟(jì)可靠、靈敏度高、環(huán)境友好，適用于嬰兒配方奶粉中四環(huán)素類(lèi)抗生素的定性定量分析。