黑菊芋多酚提取及抗氧化活性分析

姬妍茹， 許博超， 楊慶麗， 魏連會， 石 杰， 董 艷， 劉宇峰

(1.黑龍江省科學院 大慶分院， 黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學 生命科學技術學院， 黑龍江 大慶 163319)

菊芋(Jerusalem artichoke)又名洋姜、鬼子姜，塊莖含有碳水化合物、氨基酸、維生素等[1]，碳水化合物主要包括菊糖、淀粉、多聚戊糖等，其中菊糖含量最高，占塊莖干重的50%～75%[2]，具有降血脂，雙向調控血糖，改善腸道，防治便秘等功能[3]。

隨著菊芋產量逐年增大，如何深度加工增加其經濟附加值，成為制約菊芋產業發展的關鍵因素。菊芋的傳統加工方式主要是腌制醬菜，近年來新增了菊芋茶包[4]、菊芋飲料[5]、菊芋酒[6]和菊粉等多種加工方式，最常見的是生產菊粉、果糖和低聚果糖[7]。黑菊芋是以鮮菊芋為原料，利用獨特的工藝加工而成，因其色澤黝黑，口感酸甜軟彈，類似果脯，也稱為“黑菊芋脯”[8]。黑菊芋的研制成功為菊芋提供了新的加工方式，填補了國際空白，對菊芋產業的發展將產生良好的推動作用，現已明確其主要營養成分和風味物質構成[9-10]，但對活性成分還未開展研究。

多酚是一類廣泛存在于植物體內的多元酚類化合物，被稱作“第七類營養素”[11]，具有很強的生物活性，例如抗氧化[12]、抗菌[13]、抗炎[14]、抗癌[15]等。鮮菊芋中的多酚含量較少，加工成黑菊芋后含量顯著提高[9]，實驗擬利用超聲輔助法提取黑菊芋中多酚類物質，采用正交試驗設計進行提取工藝的優化，并以多酚提取液進行DPPH自由基、羥自由基清除能力和鐵離子還原力實驗，驗證其抗氧化功效，以期為成果推廣提供理論依據，同時為黑菊芋中多酚類物質的深度開發應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑菊芋以江蘇省沛縣晨玉特種蔬菜有限公司的紅果菊芋為原料，利用大慶分院機電研究所自制設備生產；福林酚、乙醇、碳酸鈉、沒食子酸等試劑均為國產分析純，實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

Master-D UF型實驗室超純水機，上海和泰儀器有限公司；HPX-9082MBE型恒溫培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；R201型旋轉蒸發儀，上海申勝生物技術有限公司；HH-1型數顯恒溫水浴鍋，金壇市盛藍儀器制造有限公司；LDZX-40SCI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療儀器廠；DHG-9070A型鼓風干燥箱，上海飛越實驗儀器有限公司；ML204型電子分析天平，梅特勒托利多(上海)有限公司；BCD-215T BDZ型冰箱，青島海爾股份有限公司；GT10-1型高速離心機，北京時代北利離心機有限公司；KQ3200型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；Epoch酶標儀，美國BioTek公司。

1.3 實驗方法

1.3.1黑菊芋的制作

將鮮菊芋塊莖洗凈吹干后，裝入密封耐高溫塑料袋，放入加工設備中，采用變溫加熱方式進行加工(在5 h內由室溫逐漸升至93 ℃，歷經83、78、60 ℃三次降溫，每個溫度保持一定時間，最后再降至室溫)，總加工時間為15 d，顏色變為黑褐色，再經烘干降低水分至30%左右，得到成品黑菊芋，4 ℃左右保存備用。

1.3.2菊芋多酚提取

將黑菊芋切成薄片，用研缽磨成泥狀。然后稱取0.5 g左右(精確到0.000 1 g)，以乙醇水溶液為溶劑進行超聲提取。

1.3.3實驗設計

以乙醇體積分數(0、35%、55%、75%、95%)，提取溫度(25、40、55、70、85 ℃)，料液比(g/mL)(1∶5、1∶15、1∶25、1∶35、1∶45)、提取時間(15、30、45、60、75 min)為單因素進行實驗，并以此為基礎進行正交試驗，確定黑菊芋多酚的最佳提取工藝。

1.3.4總多酚含量檢測

采用福林酚法，參照國標檢測方法，略有改動[16]。以沒食子酸為標準品，準確稱取(0.055±0.001) g，用水溶解并用容量瓶定容至50 mL，得1.0 mg/mL標準沒食子酸溶液。分別移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，于50 mL容量瓶中制成沒食子酸工作液。用移液器分別移取沒食子酸工作液、水及測試液各1.0 mL于刻度試管內，加入5.0 mL的10% Folin-Ciocalteu試劑，搖勻后加入7.5%碳酸鈉溶液4.0 mL，加水定容至14.0 mL，搖勻，室溫下放置1.0 h后分別測定765 nm處溶液的吸光度。然后以吸光度為縱坐標，對應標準品的含量為橫坐標繪制標準曲線。回歸方程及標準曲線見圖1，總多酚提取率(mg/g)見式(1)。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

(1)

實驗中吸取樣品液1.0 mL，3次重復，按實驗步驟測定其吸光度，以標準曲線計算總多酚含量。

1.3.5DPPH自由基清除率測定

根據文獻[17]，稱取一定量的DPPH，用無水乙醇配制成0.2 mmol/L 的DPPH 溶液。吸取1.0 mL菊芋或黑菊芋多酚提取液，用無水乙醇補至2.0 mL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液2.0 mL充分混勻，避光放置30 min，以等體積無水乙醇做空白對照，測定517 nm處的吸光度。清除率計算見式(2)：

(2)

式(2)中：A0為對照組吸光度，A1為樣品組吸光度。

1.3.6羥自由基清除率測定

參照文獻[18]，吸取1.0 mL的菊芋和黑菊芋多酚提取液于刻度試管中，用超純水補至2.0 mL，加入10 mmol/L FeSO4·7H2O溶液1.0 mL，再加入10 mmol/L水楊酸乙醇溶液1.0 mL，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1.0 mL啟動反應，37 ℃反應30 min，對照組用超純水替代菊芋多酚提取液。測定510 nm處的吸光度。清除率計算見式(3)：

(3)

式(3)中：A0為不加色素的吸光度，A1為測定液的吸光度，A2為色素本底的吸光度。

1.3.7鐵離子還原力測定

吸取1.0 mL的菊芋和黑菊芋多酚提取液于具塞刻度試管中，用超純水補至2.0 mL，加入0.2 mol/L pH值6.6的磷酸鹽緩沖溶液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，混勻后50 ℃恒溫20 min，立即冷卻，加入三氯乙酸溶液2.5 mL，混合后3 000 r/min離心10 min(如無沉淀可不離心)，取上清2.5 mL，加入2.5 mL去離子水及0.5 mL 三氯化鐵溶液，迅速混勻，測定700 nm處的吸光度，以超純水作為零參比。

1.3.8數據處理

采用SPSS統計學軟件處理分析，組間比較采用t檢驗方法，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同提取條件對黑菊芋總多酚提取效果的影響

2.1.1提取溫度與黑菊芋總多酚提取效果的關系

當其他條件一定時，隨著超聲溫度的升高，黑菊芋中總多酚的提取率逐漸上升，當溫度為70 ℃時，總多酚的提取率達到最大值6.25 mg/g，之后開始緩慢下降，見圖2。因此溫度因素選擇 55、70、85 ℃ 3個水平進行正交試驗。

圖2 提取溫度對黑菊芋總多酚提取效果的影響Fig.2 Effects of temperature on extraction yield of polyphenols from black Jerusalem artichoke

2.1.2乙醇體積分數與黑菊芋總多酚提取效果的關系

當其他條件一定時，隨著乙醇體積分數的提高，黑菊芋中總多酚的提取率呈先上升后下降的趨勢，乙醇體積分數為55% 時，提取率最高為4.98 mg/g，之后逐漸下降，見圖3。因此乙醇體積分數因素選擇 35%、55%、75% 3個水平進行正交試驗。

圖3 乙醇體積分數對黑菊芋總多酚提取效果的影響Fig.3 Effect of ethanol concentrations on extraction yield of polyphenols from black Jerusalem artichoke

2.1.3料液比與黑菊芋總多酚提取效果的關系

當其他條件一定時，在乙醇溶液體積達到25 mL以前，多酚物質的提取率明顯升高，之后隨著乙醇體積的增加，提取率變化趨緩，并且有下降的趨勢，見圖4。因此料液比因素選擇 1∶25、1∶35、1∶45這3個水平進行正交試驗。

圖4 料液比對黑菊芋總多酚提取效果的影響Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratios on extraction yield of polyphenols from black Jerusalem artichoke

2.1.4提取時間與黑菊芋總多酚提取效果的關系

當其他條件一定時，隨著超聲時間的延長，黑菊芋中總多酚的提取率逐漸上升，當時間為60 min時，總多酚的提取率達到最大值5.35 mg/g，之后開始急劇下降，見圖5。因此時間因素選擇 45、60、75 min這3個水平進行正交試驗。

圖5 提取時間對黑菊芋總多酚提取效果的影響Fig.5 Effects of ultrasonic time on extraction yield of polyphenols from black Jerusalem artichoke

2.2 正交試驗結果

在單因素實驗結果的基礎上，進行四因素三水平正交試驗，對超聲輔助黑菊芋多酚提取工藝進行正交試驗優化，結果見表1。

從表1極差分析結果可以看出，4個因素對黑菊芋多酚提取率的影響由大到小依次為提取溫度(C)、乙醇體積分數(A)、提取時間(B)、料液比(D)。在正交試驗設計范圍內，得到超聲提取黑菊芋多酚的優化條件為A2B2C3D1，即乙醇體積分數為55%，料液比(g/mL)為1∶35，提取溫度為85 ℃，提取時間為45 min。

表1 正交試驗設計及結果分析

2.3 黑菊芋體外抗氧化活性分析

2.3.1菊芋總多酚提取及含量測定結果

采用超聲輔助的方法提取鮮菊芋和黑菊芋多酚，工藝參數依據正交試驗的優化水平組合，超聲提取2次，合并濾液，先用旋轉蒸發儀揮發出乙醇，然后用電磁爐80 ℃濃縮，最后定容至100 mL，所得溶液稱為原液。鮮菊芋原液質量濃度為0.114 9 g/mL，黑菊芋為0.123 2 g/mL。鮮菊芋樣品含水量為71.00%，黑菊芋含水量為36.24%。按照1.3.4節中的方法測定，以干基計算，鮮菊芋的多酚質量比為1.13 mg/g，黑菊芋的多酚質量比為6.41 mg/g，是鮮菊芋的5.67倍。由于本研究未對菊芋和黑菊芋多酚進行分離純化，因此以下實驗中采用多酚粗提液進行抗氧化分析，為方便加工前后樣品之間的比較，實驗以樣品質量作為橫坐標進行對比分析。

2.3.2DPPH自由基清除能力測定結果

DPPH是一種有機自由基，被廣泛應用于定量檢測食品的抗氧化能力[19]。本實驗利用DPPH體系對菊芋總多酚粗提液清除自由基進行研究，結果如圖6。當質量均為1.0 mg時，黑菊芋與鮮菊芋對DPPH自由基清除率差異顯著(P<0.05)，隨著質量增加黑菊芋對DPPH自由基的清除能力明顯增強(P<0.01)，清除率分別為同質量鮮菊芋的1.08～1.54倍。菊芋對DPPH自由基的清除能力與其多酚含量具有一定相關性，黑菊芋和鮮菊芋的相關系數分別為0.858 2和0.953 6。

圖6 菊芋和黑菊芋對DPPH自由基的清除效果Fig.6 DPPH· scavenging activity of fresh and black Jerusalem artichoke

2.3.3羥自由基清除能力測定結果

羥自由基是一種活性氧，能殺死紅細胞，降解DNA、細胞膜和多糖化合物，也是引起衰老和某些疾病的重要原因之一，從食物提取物中尋找羥自由基清除劑，對于緩解上述損傷，延緩衰老具有重要意義[20]。鮮菊芋和黑菊芋總多酚粗提液對羥自由基的清除率隨含量增加而增強(見圖7)。當質量為10.0 mg時，黑菊芋與鮮菊芋對羥自由基的清除率差異顯著(P<0.05)，隨著質量增加黑菊芋對羥自由基的清除能力明顯增強(P<0.01)，黑菊芋對羥自由基的清除率分別為同質量鮮菊芋的1.02～1.28倍。清除能力與多酚含量具有較好的相關性，黑菊芋和鮮菊芋的相關系數分別為0.929 3和0.965 8。

圖7 菊芋和黑菊芋對羥自由基的清除效果Fig.7 Hydroxyl free radicals scavenging activity of fresh and black Jerusalem artichoke

2.3.4鐵離子還原力測定結果

一般而言，樣品的還原力與抗氧化活性有著明顯的相關性，吸光度越大說明對應樣品的還原力越強。黑菊芋和鮮菊芋總多酚粗提液對鐵離子的還原能力隨質量的增加而增強，見圖8。在測試的樣品質量范圍內，與同質量鮮菊芋相比，黑菊芋對鐵離子還原力分別為同質量鮮菊芋的2.56～3.98倍，差異極顯著(P<0.01)。而且其還原力大小與多酚含量具有良好的相關性，黑菊芋和鮮菊芋的相關系數分別為0.994 6和0.985 1。

圖8 菊芋和黑菊芋對鐵離子的還原力Fig.8 Ferric reducing antioxidant power of fresh and black Jerusalem artichoke

3 結 論

目前，還沒有關于菊芋中多酚組成的相關報道，多酚提取和含量測定也沒有標準的方法。鞏慧玲等[21]借鑒了牡丹花中多酚的測定方法，以鄰苯二酚為標準品，測得幾種菊芋的多酚質量比在0.66～1.55 mg/g。本研究參考GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》中Folin-Ciocalteu法對菊芋提取液進行多酚含量檢測，以沒食子酸為標準品，測得紅果菊芋的多酚質量比為1.13 mg/g。同時開展了超聲輔助提取黑菊芋多酚的研究，并在單因素實驗的基礎上通過正交試驗對黑菊芋的多酚提取工藝進行優化，確定優化提取工藝條件為乙醇體積分數55%，料液比(g/mL)1∶35，提取溫度85 ℃，提取時間45 min，此時的提取率為6.26 mg/g。

經變溫加熱工藝處理后，黑菊芋中的多酚含量顯著高于鮮菊芋，對DPPH自由基、羥自由基的清除能力和鐵離子還原力均顯著高于鮮菊芋，各抗氧化指標均與多酚含量具有較好的相關性，相關系數分別為0.853 2、0.929 3和0.994 6。本研究為黑菊芋新產品的推廣提供了基礎數據。