雞白湯多肽序列組成與乳化性能相關性研究

段娜娜， 張天睿， 廖永紅， 周曉宏，*

(1.北京理工大學 化學與化工學院， 北京 100081； 2.北京工商大學 食品學院， 北京 100048)

乳化是指互不相溶的兩相液體，其中一相以液滴分散在另一相中[1]。在食品工業中，這兩種互不混溶的液體通常是油和水，液滴的平均直徑在0.1～100 μm。根據不同相的相對空間分布，乳液通常可分為水包油(O/W)乳液，例如牛奶、冰淇淋、湯、醬汁等；油包水(W/O)乳液，例如黃油、人造奶油等[2]。表面活性劑是一類能顯著降低溶劑表面張力的物質，它的分子由兩部分組成：一部分是親水基，另一部分是疏水基。生物表面活性劑大多是由微生物產生的具有表面活性劑特征的化合物，與一般表面活性劑類似。生物表面活性劑同樣具有兩親性結構，疏水端大多為長的脂肪酸鏈或烴鏈，親水端一般為糖、多糖、環肽類、氨基酸類及多元醇等[3]。與化學合成表面活性劑相比，生物表面活性劑具有選擇性好、用量少、無毒、能夠被生物完全降解、環境友好等特點[4]。生物表面活性劑在食品工業中可作為食品添加劑，如乳化劑、增稠劑、保鮮劑等，改變食品的稠度、黏度、口感、新鮮度等，在人體消化過程中可以被分解、吸收或排出體外，對人體無毒副作用[5-7]。天然食品級乳化劑如蛋白質、多糖、磷脂、皂苷的鑒定、表征與應用已有不少研究報道。這些乳化劑的結構、性質與形成乳液穩定性的關系更是研究的重點和熱點。人們還研究了pH值、溫度、離子強度對天然乳化劑乳化作用的影響。這些研究有助于促進天然乳化劑在乳液基食品、飲料化妝品甚至藥品中的廣泛應用[8-10]。目前，對純多肽表面活性劑的研究鮮有報道，研究多肽表面活性劑的結構和乳化機理對開發新型營養、安全、多功能多肽表面活性劑具有重要意義。

本研究基于我國燉制雞白湯的傳統，以雞骨架為原料，擬通過傳統方法燉煮雞湯，獲得均一、穩定的乳化體系，對該乳化體系進行乳化性能和乳化穩定性表征。將雞湯多肽進行分離，采用高壓液相色譜與高分辨率的Q-Extractive二級質譜聯用技術分析乳化多肽的序列；研究高效多肽表面活性劑的序列特征，總結多肽表面活性劑的氨基酸序列組成與乳化性能之間的關系，希望為高效多肽表面活性劑的開發提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

肉雞雞骨架購自北京新發地批發市場。

1.2 儀器與設備

XSP-605型生物顯微鏡，上海上天精密儀器有限公司；紫外分光光度計，北京瑞利分析儀器有限公司；NDJ-1型旋轉式黏度計，上海高致精密儀器有限公司；JYW-200B型全自動界面張力儀，承德建德檢測儀器有限公司；Vivaspin6型離心濃縮管、16532-K型針頭濾器(0.22 μm)、17598-K型針頭濾器(0.45 μm)，德國Sartouris公司；UDK159型全自動凱氏定氮儀，意大利VELP公司；L8900型氨基酸分析儀，日本日立集團；DIONEX UltiMate 3000 RSLC型液相色譜儀、Q-Exactive型質譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1雞白湯燉煮及乳化多肽制備

雞骨架用溫水沖洗血污，去掉尾脂腺、肺和氣管，剁成2 cm方塊。稱得凈重后加入2倍質量的冷水，大火燒開，煮沸10 min，去掉血沫，轉小火燉煮3 h，獲得雞白湯。雞白湯4 000 r/min離心10 min后分為三層，最上層為油層，中間為乳液層，最下層有少量沉淀。用移液管吸取雞湯中間乳化液，與環己烷1∶1混溶，充分振蕩后加到分液漏斗內，去除上層環己烷萃取液，分離得到下層雞湯多肽水溶液。取100 mL下層溶液，分5次與一定量的海砂在培養皿中混合，60 ℃干燥。干燥物經索氏抽提去除脂肪，得到雞湯乳化層多肽固體樣品。樣品用100 mL蒸餾水溶解，再分別利用0.45 μm和0.22 μm針頭濾器微濾處理，得到雞湯乳化多肽溶液。取5 mL多肽溶液用于多肽序列分析，其余多肽溶液用凱氏定氮法測定蛋白含量，并測定不同濃度下多肽溶液的表面張力。

1.3.2雞湯乳化體系性能表征

1.3.2.1 乳化穩定性測定

經2 000、3 000、4 000 r/min等不同轉速離心10 min后的雞湯，取中間乳化層，滴一滴于載玻片中央，利用光學顯微鏡觀察，取中間視野15個顆粒并用測微尺統計顆粒直徑大小。參考曾清清等[11]的方法，將離心后得到的乳化層稀釋2倍，在540 nm波長下測定樣品吸光度A0。在4 000 r/min條件下離心樣品10 min，并在相同波長下測定離心后樣品的吸光度值A1。設R值(穩定性系數)=A1/A0(R≤1)。R值越大，說明乳液的乳化穩定性越好[12-14]。

1.3.2.2 黏度測定

利用旋轉式黏度計，選取合適的轉子和轉速，用250 mL燒杯盛裝原雞湯或離心微濾后的雞湯乳化多肽樣品，進行黏度測定。比較蒸餾水、雞湯原液、雞湯乳化多肽的黏度值。

1.3.2.3 表面張力測定

利用全自動界面張力儀[15]，分析不同濃度離心微濾后的乳化多肽溶液表面張力的變化，以確定雞湯乳化多肽的臨界膠束濃度(cmc)值范圍。

1.3.3總蛋白含量測定

取離心微濾后的乳化多肽溶液1 mL于消化管中，加入7 g混合催化劑(K2SO46.36 g，CuSO40.64 g)、20 mL濃硫酸，于420 ℃消化1.5 h，冷卻至50～60 ℃。參考GB/T 601—2016的方法對配制的HCl溶液進行標定，HCl濃度為0.104 3 mol/L，利用全自動凱氏定氮儀測定總蛋白含量。

1.3.4氨基態氮含量的測定

采用甲醛滴定法，準確吸取離心微濾后的乳化多肽溶液5 mL，置于200 mL燒杯中，加60 mL水，用濃度為0.050 mol/L的氫氧化鈉標準溶液滴定至pH值為8.2。加入10 mL甲醛，混勻，再用氫氧化鈉標準溶液繼續滴定至pH值為9.2,記下消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積，同時做空白對照。按照式(1)計算氨基態氮含量。

(1)

式(1)中，V1為樣品加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準溶液的滴定體積，mL；V2為空白試樣加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準溶液的滴定體積，mL；c為氫氧化鈉標準滴定溶液的濃度，mol/L。

1.3.5游離氨基酸含量的測定

取500 μL離心微濾后的乳化多肽溶液，加入9.5 μL 5%磺基水楊酸混合均勻，靜置2 h。取上清液500 μL在10 000 r/min條件下離心15 min。取上清液，稀釋6倍，上機測試。氨基酸分析儀測試條件：色譜柱，流速0.4 mL/min，柱溫57 ℃。茚三酮反應柱，反應溫度135 ℃，流速0.35 mL/min，進樣量20 μL，分析時間50 min，波長為570、440 nm。

1.3.6多肽組序列分析

將離心微濾后的多肽溶液，利用截留3 000 Da的超濾離心管進行超濾(3 000 r/min，10 min)，于-20 ℃保存備用。利用0.1%TFA將樣品復溶，并用液相色譜儀，與質譜儀直接相連，用構成的液質聯用系統對樣品進行梯度洗脫分離。洗脫流速為0.25μL/min，梯度洗脫分離時間為65 min。分析柱為150 mm×75 μm的熔融石英毛細管柱，將其與C18樹脂組合形成自制分析柱。流動相A含有0.1%的甲酸，流動相B是含有100%乙腈和0.1%甲酸的混合液。MS 使用單一全掃描質譜 Orbitrap，并通過軟件Xcalibur 2.2采集數據。用LC-MS/MS圖譜檢索UniProt數據庫，獲得雞湯乳化多肽組序列。

2 結果與分析

2.1 雞白湯離心乳化穩定性分析

在不同離心轉速條件下，雞白湯乳化顆粒直徑大小分布和乳化穩定性如表1。從表1可以看出，隨著離心轉速增加，乳化顆粒更加細小，分布更加均勻，乳化穩定性也隨之增加。從動力學角度解釋，乳化顆粒越小，在液滴聚并[16]速度相同的情況下，由乳狀液變成兩相彼此分離的液體所需要的時間越長，即乳狀液越穩定，且大小分布均勻的乳狀液比具有較寬粒子分布的乳狀液要穩定得多；因此，后續實驗所用雞湯乳化體系，均在4 000 r/min離心10 min條件下所得，以保證乳化液的最佳穩定性。

表1 不同離心條件下雞白湯乳化顆粒直徑與穩定性

2.2 雞白湯乳化多肽蛋白含量及多肽平均長度分析

離心微濾后的乳化多肽溶液通過凱氏定法測得的總蛋白含量為1.3 g/100 mL，氨基酸分析儀測得游離氨基酸含量為0.15 g/100 mL，甲醛滴定法測得的氨基態氮含量為0.038 g/100 mL，按照式(2)計算多肽水解度。

(2)

多肽的平均長度約為13個氨基酸殘基。

2.3 黏度測定結果分析

在室溫下，選用旋轉式黏度計的1號轉子進行測定，雞湯原液黏度為4.2 mPa·s，原液稀釋20倍后黏度為3 mPa·s，而離心微濾后的乳化多肽溶液黏度為2.5 mPa·s，其稀釋20倍后與同體積蒸餾水黏度(1 mPa·s)相近。由黏度測定結果推測雞湯原液中起增稠作用的主要是大分子蛋白、長肽以及油脂等大分子物質，這些分子在流體流動時將受到更大的摩擦力，表觀黏度更高。

2.4 表面張力測定結果分析

表面活性劑的表面活性通常用加入表面活性劑后溶劑表面張力的降低及其形成膠束的能力兩個性質來表征，而膠束化能力用cmc表示，cmc越小，表面活性劑越容易在溶液中自聚形成膠束[17]。本實驗測定了離心微濾后的雞湯多肽溶液的表面張力隨濃度的變化關系，雞湯多肽濃度通過凱氏定氮法測定，如圖1。由圖1γ-c曲線可看出，雞湯多肽cmc值為4 mg/mL時溶液表面達到飽和吸附，開始有膠束形成；超過cmc后，盡管多肽濃度繼續增加，但溶液的表面張力幾乎不再下降，穩定在42 mN/m左右。

圖1 雞湯多肽γ-c曲線Fig.1 γ-c curve of chicken broth polypeptides

2.5 多肽序列疏水度分析

通過HPLC-MS分析雞湯乳化多肽的二級質譜，利用UniProt數據庫檢索，獲得1646條多肽序列。為了表征多肽的疏水度，從自由能角度考慮，采用Ney (1971) 提倡的Q規則[18]，即Q=∑Δft/n，其中Q為多肽的平均疏水度，Δft為氨基酸側鏈的相對疏水度，n為氨基酸殘基數，Q值分析結果見圖2。圖2中，1 646條多肽的Q值均在9 000 kJ/mol以下，其中有1 349條多肽的Q值在3 000～6 000 kJ/mol，占多肽總數量的82%，而Q值在3 000 kJ/mol以下多肽數量最少，只有77條，占比5%。

圖2 雞湯多肽平均疏水度分布Fig.2 Distribution of average hydrophobicity of chicken broth polypeptides

對1 349條多肽序列進一步統計分析，從多肽的平均疏水度來看，這些多肽的Q值平均值為4 791.70 kJ/mol。以丙氨酸的Δft值3 056 kJ/mol作為疏水性氨基酸的分界線，Δft值<3 056 kJ/mol為親水性氨基酸，Δft值≥3 056 kJ/mol則為疏水性氨基酸。在1 349條多肽序列中，疏水性氨基酸殘基的平均Δft值為8 034.87 kJ/mol，多集中于6 000～10 000 kJ/mol(1 236條)，占比92%；疏水性氨基酸殘基的平均Δft在10 000 kJ/mol以上(59條)，僅占4%(圖3)；68%(即1 646條多肽的56%)的多肽序列中疏水性氨基酸占比主要集中于40%～60%(436+475=911條)，說明雞湯主體乳化多肽疏水性氨基酸與親水性氨基酸的占比比較接近，疏水性氨基酸占比很高或親水性氨基酸占比很高的多肽數量較少(圖4)。圖5為雞湯多肽中各種疏水性氨基酸和親水性氨基酸殘基的占比，出現最多的疏水性氨基酸為Ala和Lys，最少的是Trp和Cys；出現最多的親水性氨基酸為Glu和Gly，最少的是His和Asn。強親水性氨基酸Gln、Asn和強疏水性氨基酸Trp、Tyr、Ile總體上占比不高。

圖3 雞湯多肽疏水性氨基酸殘基的疏水值分布Fig.3 Distribution of Δft value of hydrophobic amino acids of chicken broth polypeptides

從氨基酸殘基在乳化多肽兩端的分布來看，N端、C端均以親水性氨基酸居多，N端為親水性氨基酸的多肽有712條，占比53%；C端為親水性氨基酸的多肽有739條，占比55%。N、C兩端一端疏水、一端親水(698條)的多肽所占比例為52%，兩端同為親水性氨基酸(377條)的多肽占比28%，同為疏水性氨基酸(274條)的多肽占比為20%。N、C端一端疏水、一端親水的多肽中，N端以疏水氨基酸為主，且多為Lys、Ala和Pro，C端以親水氨基酸為主，且多為Glu、Gly和Thr。

圖4 雞湯多肽疏水性氨基酸比例分布Fig.4 Distribution of hydrophobic amino acids in chicken broth polypeptides

3 結 論

雞湯乳化多肽平均長度約為13個氨基酸殘基，cmc值為4 mg/mL，具有較好的表面活性，能夠明顯降低溶液的表面張力。通過HPLC-MS分析得到1 646條雞湯乳化多肽序列，多肽平均疏水度為4 791.70 kJ/mol，其中82%的乳化多肽Q值在3 000～6 000 kJ/mol；56%的乳化多肽序列中疏水性氨基酸占比主要集中于40%～60%，雞湯主體乳化多肽疏水性氨基酸與親水性氨基酸的占比接近，疏水性氨基酸占比很高或親水性氨基酸占比很高的多肽數量較少。出現最多的疏水性氨基酸為Ala和Lys，最少的是Trp和Cys；出現最多的親水性氨基酸為Glu和Gly，最少的是His和Asn；強親水性氨基酸Gln、Asn和強疏水性氨基酸Trp、Tyr、Ile總體占比不高。乳化多肽N端、C端以親水性氨基酸為多，兩端均為疏水氨基酸的很少。與傳統表面活性劑一邊親水、一邊疏水的結構不同，雞湯乳化多肽是一種疏水性基團和親水性基團相互交織的結構。合成組成相同的兩種多肽表面活性劑：一種為一邊親水、一邊疏水的多肽表面活性劑，另一種為親疏水性氨基酸殘基相互交錯的多肽表面活性劑，比較兩種多肽表面活性劑特性，對進一步闡明多肽表面活性劑的構效關系將具有積極意義。研究結果對于開發新型多功能多肽表面活性劑具有一定的參考價值。

圖5 雞湯多肽各種氨基酸分布情況Fig.5 Ratio of amino acids of chicken broth polypeptides