低濃度紫杉醇與替莫唑胺作用膠質瘤U87的機制

梁會娟 梁海乾 魏向陽 周 欣 張 賽

膠質瘤屬于神經系統的一種惡性腫瘤，其發病率最高，據相關調查報道顯示：顱內惡性腫瘤的發病率為每年每10萬人中有6.8人，而其中膠質瘤就占到80%[1]。目前普遍采用手術切除并輔以術后放、化療治療膠質瘤，化療在諸多治療環節中至關重要，其成敗對病人的生活質量和預后影響很大。隨著應用時間的延長，替莫唑胺、紫杉醇，療效下降與耐藥趨勢越來越明顯，且耐藥均與P53相關，兩者聯合，能否起到起到協同作用?，F將研究結果報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料 膠質瘤細胞U87（武警后勤學院附屬醫院腦研所），PTX、TMZ（由美國Sigma公司提供），胎牛血清（由美國Hyclone公司提供），DMEM培養基（由美國Gibco公司）提供，CCK-8試劑盒（由武漢博士德公司提供）。

1.2 細胞培養 將U87膠質瘤細胞置入10%胎牛血清HDMEM中進行培養，放入37 ℃培養箱內，5%CO2，并用0.25%胰蛋白酶消化傳代，每3天1次。

1.3 TMZ、PTX半數抑菌濃度（IC50）確定 ①對數生長期U87細胞，按1×103/孔接種于96孔培養板，24 h。②加入濃度PTX（0.5、0．03125 ng/mL）或TMZ（5、0.3125 μg/mL）或兩者混合液干預細胞24 h、48 h、72 h后，設5個復孔，加入每孔CCK-8溶液（5 mg/mL）10μL，終體積100 μL，孵育1 h，采用全自動酶標儀，波長450nm下測定光密度（OD）值，生長抑制率（%）=（OD對照－OD藥物）/（OD對照－OD空白）×100%。

1.4 統計學方法 采用SPSS 11.0統計軟件處理數據。計量資料采用（）表示，采用配對t檢驗比較（雙側），P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PTX、TMZ、PTX+TMZ細胞生長抑制率的比較[1]PTX、TMZ的IC50分別為0.5 ng /mL和5 μg/mL，PTX+TMZ與TMZ、PTX單獨作用于U87的結果比較：0.03125 ng/mL PTX與0.3125 ng/mL TMZ兩個濃度聯合，在24 h與48 h呈現拮抗作用，差異有統計學意義（P均＜0.01）；72 h兩者聯合呈現協同作用，差異具有統計學意義（P均＜0.01）；5 ng/mL PTX與0.5 ug/mL TMZ兩個濃度聯合，與二者單獨作用比較，24 h、48 h內呈拮抗作用（P均＜0.01）。作用72 h與兩者單獨作用比較，差別沒有統計學意義。見表1。

表1 PTX、TMZ、PTX+TMZ細胞生長抑制率

2.2 光鏡下的聯合作用圖片[2]72 h后，鏡下可見大量的巨核細胞，紡錘體形成，細胞周期阻滯于M期，有絲分裂停止。見圖1b。

注：圖1a：200倍光鏡下U87細胞干預前圖片；圖1b干預后（0．03125+0．3125 PTX+TMZ聯合作用72 h后）的圖片。

3 討 論

膠質瘤屬于中樞神經系統的一種比較常見的惡性腫瘤，在侵襲過程中猶如樹根一樣生長和擴張。盡管現階段對于膠質瘤治療可采用免疫學方法先進性標記，然后使用免疫顯微鏡將病變組織盡可能地切除，但是由于患者的顱內解剖以及功能定位的復雜性，使得完全切除存在非常大的困難，患者在手術后實施放化療輔助治療也仍然無法完全遏止惡性膠質瘤的發展，預后往往不樂觀。根據世界衛生組織的統計調查顯示，膠質瘤Ⅲ級患者的生存期通常只有2～3年，而Ⅳ級患者生存期僅僅只有1年左右，如膠質母細胞瘤患者[3]。

從表1我們看到，48 h內呈現拮抗作用，72 h后表現為協同作用，且在1/6治療劑量下，兩者協同作用發揮到了最大。光鏡下（圖1）見兩者聯合作用有絲分裂相停滯于M期，大量紡錘體形成，細胞呈巨核細胞表現。分析紫杉醇是一種水溶性分子，作用于微管網，與N端31位和217-231位氨基酸結合，誘導和穩定微管蛋白，細胞周期阻滯于G2/M期。盡管無法對DNA直接起作用，但是其可以對Raf-1的級聯反應產生誘導，并進一步誘導P53表達，導致Raf-1/Bcl-2磷酸化，抑制Bcl-2，從而引起了P53表達的上調。研究表明，紫杉醇耐藥性與P53的表達相關，Li G等[4]研究中利用P53突變或者沉默構建小鼠模型，通過實驗顯示，8 mg/kg的紫杉醇和劑量為2Gy的放療在移植了非小細胞肺癌的小鼠模型中具有明顯的抑制作用[5]。替莫唑胺屬于烷化劑，在人體當中通過非酶解途徑可以促進DNA的甲基化作用，甲基化產物包括了N3、N7位的甲基化與O6-甲基鳥嘌呤（O6-mG）的甲基化。國外有研究報道了分別使用不同劑量替莫唑胺（25 ummol/L和50 ummol/L）作用于MGMT甲基化與O6-甲基鳥嘌呤DNA-甲基轉移酶（MGMT）的剔除模型，結果顯示替莫唑胺耐藥性和MGMT具有顯著的劑量相關性，同時和P53的表達相關。兩者共同對P53產生作用，對核糖核苷酸還原酶基因的表達具有上調作用，同時保證DNA的穩定[6]。Gori JL等[7]人以基因修飾后高表達MGMT的狗模型為實驗對象，對其采用替莫唑胺和卡氮芥治療，當兩者的活性分別為550～850 mg/m2和150 mg/m2時與離體時劑量的5倍相當。國內學者丁照義及其導師帶領的課題組，以膠質瘤大鼠為實驗對象，開展了體外培養大鼠膠質瘤C6細胞實驗，通過研究結果顯示，給予大鼠紫杉醇、替莫唑胺后，大鼠的膠質瘤細胞生長收到明顯的抑制，并且細胞出現凋亡，并且通過驗證發現，二者聯用的效果比單獨用藥效果更為理想，由此指出，這種作用效果是與Caspse-3 mRNA表達上調有關[6]。

總之，紫杉醇與替莫唑胺聯合，可以發揮明顯的協同作用，隨著作用時間的延長，細胞內的修復系統功能耗竭，損傷瀑布啟動，酸中毒、缺氧、營養不良的微環境逐步惡化，遺傳物質、新陳代謝及能量轉化等都發生了抑制崩潰，導致腫瘤細胞死亡。