流感病毒細胞分離培養陽性檢出的主要影響因素分析

董 悅

第一個采取全球性監測的傳染病就是流感，預防與控制流感的關鍵對策就是監測流感，每年明確流感流行株、推薦分組疫苗、盡早發現變異株等，這些措施成為預測流感疫情的基礎性工作，而監測流感的核心就是分離培養流感病毒[1]。本實驗選擇醫院收集的流感樣病例的咽拭子中PCR檢測為陽性的標本作為實驗的研究對象，實驗研究結果報道如下：

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2016年11月-2017年12月朝陽市1家國家級流感哨點醫院收集的流感樣病例的咽拭子中PCR檢測為陽性的標本作為實驗的研究對象，標本共計827份，從“中國流感監測信息系統”提取流感病例（ILI）的基本特征與標本實驗室信息。

1.2 方法 根據試劑盒說明書提取RNA與執行PCR操作，反應體系總體積參考值范圍24 μL:2×RT-PCR Buffer 12.6 μL，24×RT-PCR Enzyme Mix 1μL；上、下游引物參考標準都是0.6μL；探針參考標準為0.6μL；RNase Free Water參考標準是6μL；RNA模板參考標準是6μL。反應條件參考條件：45 ℃條件下反轉錄10 min；95 ℃條件下預熱10 min；95 ℃條件下變性15 s；60 ℃條件下擴增45 s；在45 ℃對單點熒光進行測定，總共循環42個。測定實時熒光，會有標準S 型擴增曲線產生，當Ct值小于40，判定標本呈陽性。

1.3 統計學分析 實驗所有數據全部由SPSS 19.0版統計軟件進行處理，計量資料用（）表示，采用t檢驗；計數資料用以率（%）表示，采用卡方檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 標本概況 827份陽性標本，男性525名，女性302名，男女比例為1.74:1，平均年齡（18.2±14.5）歲。流感流行時期（當年10月－次年3月）標本707份，非流感流行時期（當年4月-9月）標本120份；發病開始到采集樣本的平均時間為（1.6±1.4）d，樣本采集到收集樣本時間間隔平均為（2.2±1.9）d，樣本收集到接種時間間隔中位數為9（3～18）d；21.5%（178/827）的樣本收集前保存在-70 ℃，78.5%的樣本在收集前保存在4 ℃。PCR檢測流感病毒陽性標本中，41.8%（346/827）屬于甲型流感病毒，58.2%（481/827）屬于乙型流感病毒。

2.2 分離病毒概況 從PCR陽性標本中498份分離結果呈陽性，分離陽性率為60.2%，其中25.1%（125/498）屬于季節性H3N2、42.6%（212/498）屬于新甲型H1N1、18.1%（90/498）屬于乙型（Victoria）、14.3%（71/498）屬于乙型（Yamagata）。

2.3 影響因素 經logistic 回歸分析，性別、年齡、流行時期、采集樣本與收取樣本的時間、收集樣本前的保存手段、檢測結果等因素，都會對病毒分離結果產生一定影響，差異無統計學意義（P＞0.05），對比發病到采集樣本時間間隔與收集樣本到接種時間間隔等因素，對病毒分離結果的影響，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 logistic 回歸分析影響流感病毒分離結果因素

3 討 論

流感樣病例的發病時間不會影響流感病毒分離培養，流感病毒癥狀開始的前1 d至病后5 d為流感病毒的排毒時間，通過癥狀學監測流感，選擇有流感樣癥狀病例作為試驗對象。影響流感病毒分離培養的重要因素是送樣本的時間，最佳送檢時間是48 h內，送檢時間越早，陽性率也就越高[2]。

RNA校正酶不會參與流感病毒的復制，所以RNA 聚合酶復制1萬個左右核苷酸就有可能出現錯誤；由于流感病毒基因組節段性，導致某一個細胞會同時被類型不同的病毒所感染，以致基因重配可能產生，因此，每年流感病毒都會產生變異，而變異導致每年流感強度不盡相同[3]。

實驗研究發現，PCR核酸檢測陽性標本中，分離陽性率為60.2%。分離病毒的最終效果取決于病毒自身的存活強度與病毒在細胞或雞胚腔中存活強度，所以病毒的存活率決定病毒分離的陽性率，由此可知，影響分離培養病毒存活率的因素就是對病毒分離陽性率帶去影響的因素[4]。研究結果表明，分離陽性率不會受到病例的性別與年齡的因素的影響；由于普通人較易受流感病毒侵襲，所以不同人群有著相同的流感病毒的復制增殖的部位與方式。采集標本與送檢樣本的過程中，不論什么季節，都需要選擇全程冷鏈運輸的方式，所以不同流行季節不會太大影響到流感病毒的存活[5]。根據目前監測流感方案，采集標本后，需在4 ℃以下溫度保存；若不能保證于48 h內把標本送去檢測，就需在-70 ℃或以下溫度保存，之后于1周內送去檢測。本次實驗研究，采集的所有標本都達到方案標準，當流感病毒保存在合理溫度下，沒有通過反復的凍融，在短時間內流感病毒的存活不會受到影響，所以收集樣本之前，無論標本是保存在4 ℃還是-70 ℃的溫度下，亦或是采集樣本到收集樣本時間間隔等因素，都不會影響到分離陽性率。本次實驗研究證明，分析對比甲、乙型流感病毒的分離培養陽性率，差異無統計學意義。

試驗研究證明，發病開始到采集樣本的時間、收集樣本到接種的時間，此兩種的間隔時間越短，病毒分離的陽性率相對就會更高。相關實踐研究證明，機體感染流感病毒0.5～1 d時病毒排出達到最高值，平均排毒時間為5.0 d，感染流感病毒初期采集咽部標本，一般存活的流感病毒都比較多[6]。根據試驗條件、細胞培養周期，一般會在收集一定量流感病毒樣本后，再行病毒分離培養，低溫條件下流感病毒可以存活更長時間，但如果過長時間保存，會給細胞存活帶去影響，且多次凍融有可能降低病毒分離率。