Luminex RVP與qPCR的對比及Luminex平臺PCR產(chǎn)物污染的處理

喬金平 戴夢緣 吳丹丹 彭麗朵 費廣鶴 徐元宏

呼吸道病毒感染潛伏期短、起病急、多種病毒可引起類似的癥狀，致死率高[1]。呼吸道病毒種類繁多，給檢測和診斷帶來極大挑戰(zhàn)。核酸檢測的靈敏度和特異性均高于其他方法，因而已被廣泛用于臨床檢測[2～3]。

核酸檢測最常用的實時熒光定量PCR （qPCR）分單重和多重，單重qPCR一次只能檢測一種病原體，多重qPCR受PCR儀器限制，一般1管同時檢測不超過3種病原體（3待測加1內(nèi)對照）。而呼吸道感染常見的有十幾種病毒，且常有多種病毒的混合感染。所以一份標本要分十幾次單重qPCR或4～6次多重qPCR才能涵蓋常見呼吸道病毒，通量低且操作繁瑣[4～5]。Luminex 18種呼吸道病毒多重檢測試劑盒（RVP）可在4 h內(nèi)1管同時檢測18種常見呼吸道病毒[3]。單重qPCR相對多重檢測的RVP來說，其靈敏度和特異性都更高，因此，本研究通過與單重qPCR比對，簡單評估RVP對呼吸道病毒的檢測性能。RVP檢測有PCR產(chǎn)物雜交步驟，需開蓋取PCR產(chǎn)物進行雜交，很容易造成下一批次檢測時的污染。本研究以PCR產(chǎn)物污染的實例，探討如何排查污染源并制定防止污染的策略，現(xiàn)報告如下：

1 材料與方法

1.1 實驗材料 100例取自本醫(yī)院呼吸科的咽拭子標本。清晨進食前，使用醫(yī)用無菌生理鹽水漱口數(shù)次，用病毒采樣管配套長棉簽擦拭兩側(cè)腭弓和咽、扁桃體上的分泌物。立即送檢或于4 ℃保存并2 h內(nèi)送檢。如不能及時檢測，需于-80 ℃保存。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 QIAamp MinElute Virus Spin購自德國Qiagen；單重qPCR試劑盒[季節(jié)性H3亞型流感病毒（Influenza A H3）、A型呼吸道合胞病毒（RSV）、甲型H1N1流感病毒（Influenza A H1N1）]均購自北京金豪；18種呼吸道病毒多重檢測試劑盒（RVP）購于美國Luminex公司；病毒采樣管和配套長棉簽購于北京友康恒業(yè)公司。

1.2.2 儀器 PCR儀（博日）；高速離心機（德國Eppendorf）；Luminex 200流式點陣儀（美國Luminex）；Cobas Z480熒光定量PCR儀（瑞士Roche）。

2 實驗方法

2.1 核酸提取 取200 μL渦旋后的咽拭子標本，加入MS2 [RVP內(nèi)對照（Internal control）]，依照說明書，使用QIAamp MinElute Virus Spin試劑盒提取核酸（DNA和RNA），核酸置于-80℃保存。

2.2 qPCR 依據(jù)上述三種單重qPCR說明書，使用2.1中的核酸進行qPCR檢測。

2.3 RVP檢測 按照RVP說明書操作：①核酸提取：同2.1。②RVP多重PCR擴增：陽性對照（RVP中Run Control）為λ噬菌體，陰性對照為不含MS2的DEPC水。③PCR產(chǎn)物雜交：取PCR產(chǎn)物和 Bead Mix及SAPE工作液雜交。④上機讀數(shù)：Luminex 200讀數(shù)，TDAS分析結(jié)果。

2.4 Luminex平臺PCR產(chǎn)物雜交污染問題的處理 設(shè)計正交實驗，逐一將RVP試劑盒中PCR擴增組份及環(huán)境、耗材等進行排除，并針對可能存在污染的環(huán)節(jié)，將注意事項加到SOP中，防止污染的再次發(fā)生。

3 結(jié) 果

3.1 qPCR及RVP檢測結(jié)果 隨機選20例標本，提取的同一份核酸用qPCR和RVP同時檢測，驗證RVP的性能。見表1，RVP與qPCR對4、6和8三種病毒的檢測結(jié)果一致。后續(xù)使用RVP又檢測了80例，連同上述20例，共100例標本。其中陽性41例，有10例為混合感染（2、3、4種混合分別為6、2、2例）。

表1 20例咽拭子的qPCR和RVP結(jié)果以及二者一致性比較

3.2 Luminex平臺PCR產(chǎn)物雜交污染問題的處理 在本研究中，有一批次的結(jié)果TDAS分析后均為NO CALL，原因是陰性對照有個別分析物結(jié)果高于或接近陽性閾值，如Para 3、Para 2、Influenza B，同時此三者在待測標本中也出現(xiàn)大范圍陽性或數(shù)值偏高。本次污染考慮是在PCR加樣時遇到污染，原因包括PCR反應組份污染、耗材污染、實驗環(huán)境氣溶膠污染等。①對于耗材污染，本次污染源排查時，首先更換耗材并用純水和70%酒精清洗移液器。②對于實驗環(huán)境，采取了開窗通風、紫外線照射，使用70%酒精擦拭生物安全柜內(nèi)壁。③RVP中PCR組份包括RNase-Free、RT-PCR Buffer、Primer Mix、dNTP Mix、Enzyme Mix。RVP試劑盒價格昂貴，所以需用較小的試劑消耗來排查污染源。RVP試劑盒中Primer Mix與Enzyme Mix的量最少，其他三組份都為過量，且已分裝成多管（如證明已被污染，則直接將這三種組份同時換成新試劑即可）；因此重點排查前兩組份，同時驗證是否為實驗環(huán)境污染。為此，通過正交試驗依次進行了如表2和表3所示的4批次5種體系（A-E）排查實驗，體系A(chǔ)-D均重復兩次實驗。批次1體系A(chǔ)結(jié)果顯示仍有部分如7、11、15、16、21為陽性（表3 A1、A2），說明污染仍存在于體系中，提示除Primer Mix外的其他組份確定有污染。批次2體系B均陰性（表3 B1、B2），而體系C仍有部分分析物偏高（表3 C1、C2）。綜合第1、2批次，提示Primer Mix未被污染。批次3體系D均陰性（表3 D1、D2），提示原生物安全柜未被污染。批次4體系E均陰性（表3中E組），提示 Enzyme Mix未被污染。排查結(jié)果顯示：原生物安全柜未污染；Primer Mix和 Enzyme Mix未污染；而其他三組份可能被污染，如前所述，對此三組份直接更換新試劑。在隨后進行的標本檢測中，均未發(fā)生再次污染，也進一步驗證了排查結(jié)果的準確性。

表2 4批次排查實驗的5種組合體系

4 討 論

本研究中，我們通過從100例標本中隨機選取了20例進行了qPCR的對比檢測，以評估RVP試劑盒的性能。本次實驗僅使用了三種病毒的qPCR試劑盒，結(jié)果顯示RVP與qPCR的結(jié)果一致。RVP的檢測限要高于單個病毒的qPCR，因此在多重感染時部分病毒會出現(xiàn)假陰性的可能[5]。

本次實驗中出現(xiàn)了PCR體系的污染，PCR產(chǎn)物污染問題也是Luminex平臺在開展基于多重PCR檢測時最容易出現(xiàn)的問題。本研究以較小的代價排除了污染源，先后進行了4個批次實驗，依次更換了PCR反應組分、操作空間這兩個對PCR反應有很大影響的因素。結(jié)果提示是因為除了引物和酶外的其他三種PCR反應組份被污染。經(jīng)過文獻和相關(guān)操作規(guī)程的總結(jié)，具體防止Luminex平臺PCR產(chǎn)物污染的注意事項對所有基于PCR產(chǎn)物開蓋做雜交的實驗方法均有一定的適用性。具體注意事項如下：

表3 RVP 污染排查結(jié)果(Raw signals)

4.1 嚴格分區(qū)操作 一般分4個區(qū)，試劑準備區(qū)(Ⅰ），核酸提取和PCR加樣區(qū)（Ⅱ），PCR擴增區(qū)（Ⅲ）、雜交區(qū)及Luminex上機區(qū)（Ⅳ）。Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)在空間不夠時可以合并，因此至少分3個區(qū)。另外PCR加樣、PCR產(chǎn)物開蓋取樣雜交，均應在所在分區(qū)的全排的生物安全柜中進行。

4.2 廢物處理 所有含PCR產(chǎn)物的廢棄物均須使用能密封的袋子密封起來，再棄于遠離PCR實驗室的廢物桶。

4.3 操作習慣 在實驗操作中須養(yǎng)成良好的防污染的習慣，例如不用單手開蓋、勤換手套、加樣時移液器吸頭盒遠離廢物桶、打掉吸頭時防止飛濺、用合適的吸頭吸取試劑以避免在取樣時移液器外壁碰到試劑瓶（管）的內(nèi)壁等。

4.4 耗材和實驗環(huán)境 使用帶濾芯的吸頭，實驗前后清洗移液器內(nèi)外壁、用70%酒精擦拭生物安全柜內(nèi)壁，生物安全柜和實驗室在實驗前后需照紫外至少30分鐘，實驗室每天至少通風30 min以上。

4.5 試劑分裝 在無污染環(huán)境中對試劑盒中的主要組份進行分裝，以減少出現(xiàn)污染時的損失。綜上所述，RVP快速檢測與qPCR檢測的結(jié)果一致。如實驗中出現(xiàn)污染，可依據(jù)上述方法進行排查及預防。