RIP1 與TNF-α 誘導信號通路關系的研究進展

李承宗

腫瘤壞死因子是一類具有誘導細胞凋亡功能的細胞因子，可由多種細胞分泌、表達，其生物學功能主要涉及細胞凋亡、誘導炎癥應答、參與免疫調節等。TNF-α是腫瘤壞死因子家族最重要的細胞因子，主要通過上調MAPK、ERK、NF-κB等信號通路來誘導細胞凋亡及促炎癥作用，發揮其生理學作用。越來越多的研究證實TNF-α可通過與它的重組人1型腫瘤壞死因子受體（Recombinant Human Tumor Necrosis Factor Receptor Type 1，TNFR1）結合后啟動了下游的信號通路。RIP1是復合體I中的一種組成因子，在人體中能夠控制包括炎癥反應、細胞生存及死亡過程。RIP1目前已經成為臨床醫學控制人類炎癥反應、治療惡性腫瘤疾病的新靶點和熱點話題。因此，本文根據RIP1與TNF-α誘導信號炎癥通路的相關性進行綜述，為探索RIP1及TNF-α誘導信號通路關系治療人類惡性腫瘤疾病提供參考策略。

1 RIP1 結構和復合體相關概述

1.1 RIP復合體家族構成

RIP復合體家族是具有特異性的N末端絲氨酸（serine）、N末端蘇氨酸（threonine） 的一系列激酶活性蛋白。目前臨床上發現RIP家族共7個成員，分別為RIP1-RIP7[1-2]。RIP1-RIP7的N末端結構具有高度同源性，激酶結構域具有相似性，另外提示RIP1-RIP7蛋白家族成員可能具有某種相同或者相似的生物學功能。而RIP1-RIP7家族的中間結構、C端結構之間存在一定的差異，研究發現RIP復合體家族中的RIP1里的C端結構含有一個死亡結構域（DD，death domain），但是中間結構則包含一個RIP同型結構域（RHIM，a RIP homotypic interaction motif）和一個與相互連接的中間域（ID，a bridging intermediate domain）；RIP復合體家族中的RIP2里的C端結構則含有一個caspase募集域（CARD，caspase recruitment domain），但是其中間結構僅包含有一個ID；另外RIP3比較特別，RIP3的C端結構是RHIM且缺少中間結構域；RIP4和RIP5的C端結構都是錨蛋白域（ankyrin domains，AD），但是其中間結構則是ID；最后的RIP家族成員RIP6和RIP7的結構與其它RIP家族成員相關性較弱，目前國內外關于RIP4-7的功能的相關研究甚少[3]。筆者認為了解RIP家族各成員尤其是RIP1結構的具體了解能夠幫助臨床學者更好地探討RIP家族的生物學功能。

1.2 RIP1的分子結構分析

RIP1中間域上有一種物質為賴氨酸377（Lysine 377，Lys377），Lys377同時也是泛素分子Lys63介導的一個重要的泛素化RIP1位點，通過對RIP1位點發生泛素化影響后Lys377可以與其他泛素受體蛋白相結合并形成復合體，此時RIP1能夠與非依賴k基因結合核因（Nuclear Factor-k-gene Binding，NF-κB）發生轉錄，并通過這種方式調節人體細胞的生存狀態[4]，但是目前尚未有臨床研究對RIP1其他位點泛素化情況進行統一、明確的定義及分析。RIP1上的RHIM具有調節其他含有RHIM蛋白或相關因子的家族成員如RIP3進行相互作用的功能，RIP1在這一過程中能夠與RIP3中的RHIM相互作用并形成一個絲狀淀粉樣結構，且這一結構對調節人體中的壞死性凋亡（necroptosis）機制具有決定性作用。

RIP1成員中的C末端DD是6螺旋折疊的結構狀態，而這種6螺旋折疊結構在TNF-受體相關死亡結構域蛋白（TNF receptor-1-associated death domain protein，TRADD）和FAS相關的死亡結構域蛋白（FADD，FAS-associated death domain protein）中同樣存在，另外RIP1成員的DD能夠參與如細胞膜上與死亡配體刺激下產生受體復合物的結合的細胞同質蛋白的相互作用以及在細胞內形成復合物如與FADD的死亡結構域的結合引起凋亡（apoptosis）并起到調節下游信號的作用等[5]。

1.3 RIP1 成員的生物學功能分析

國內外關于RIP1功能的臨床研究中發現RIP成員能夠引起細胞凋亡，其機制可能是RIP1成員里的中間結構域RHIM與RIP3成員相互作用并形成功能性淀粉樣信號復合物（functional amyloid signaling complex），而這種信號復合物能夠誘導細胞發生程序性凋亡。RIP1成員對細胞的生存和死亡起決定作用，是信號通路下游死亡受體信號的中央控制器。陳瑤等[6]在一項敲除RIP1基因的小鼠相關研究中發現，敲除RIP1基因的小鼠仍然可以正常地出生并生長，但是當小鼠出生后會出現脂肪組織細胞和淋巴細胞的廣泛死亡，最終敲除RIP1基因的小鼠在3天之內全部死亡；另外Schneider等人[7]在研究中利用re-loxP 基因重組技術在敲除RIP1基因小鼠的研究中發現單獨敲除腸上皮細胞或者肝細胞的RIP1基因表達小鼠對小鼠的發育并沒有發現較為明顯的影響，提示RIP1基因可能是機體免疫淋巴系統存活和發育的關鍵性因子，作用重要。Luan等人[8]在研究中報道了成纖維細胞敲除RIP1基因后比成纖維細胞沒有敲除RIP基因對于TNF-α誘導的凋亡機制敏感性更高，另外在Jurkat細胞敲除RIP1基因后也觀察到相似的現象和情況，提示RIP1基因可能是TNF-α誘導的促生存、抗凋亡和炎癥反應發生信號通路上的重要因子。

2 RIP 基因與TNF-α 誘導的促細胞生存、炎癥反應的信號通路關系

2.1 RIP1基因參與構成、維持復體物I的過程

TRADD，RIP1，TRAF2，and cIAP1/2在促生存、抗凋亡和炎癥反應發生信號通路的TNF-α信號誘導下與胞內段的TNFR1構成復體物Ⅰ相結合并形成復合物，而RIP1基因是復合物Ⅰ的重要組成因子，另外研究發現復合物Ⅰ的主要功能是激活MAPKs/AP-1信號通路和NF-κB信號通路并促進人體細胞的生存以及導致炎癥反應的發生。

2.2 RIP1基因參與調控TNF-α誘導的NF-κB信號通路過程

NF-κB活化過程已經被多項臨床研究證明與人體的多種侵襲性惡性腫瘤的發生和發展具有密切相關性，另外在TNF-α誘導的包括NF-κB等眾多激活物中可能是最快速、有效的激活因子[9]。RIP1基因通過與連接在K377的位點上的K63泛素鏈相互鏈接能夠與TAK1（transforming growth factor（TGF）-β-activated kinase 1）信號通路、TAB2/3 （TAK1-binding proteins 2 and 3）信號通路相結合，結合后TAK1信號通路和TAB2/3信號通路能夠激活由調節亞單位IKKγ和兩個催化亞單位 IKKα和 IKKβ 組成的IKK復合物，而這個過程會引起細胞胞質中的NF-κB三聚物中的IκBα發生磷酸化反應，另外發生磷酸化反應后的IκBα被K48相互連接泛素化鏈進行修飾，最終使蛋白質發生降解。游離的NF-κB迅速移位到細胞核后與失去IκBα的暴露核定位位點 NF-κB分離，同時與特異性κB序列進行結合，進一步誘導細胞中的促生存信號的基因發生轉錄行為，提示泛素化RIP1基因在激活NF-κB信號通路中具有重要作用。相關臨床研究對存在RIP基因缺陷的Jurkat細胞、惡性黑色瘤細胞、肝癌細胞進行報道并發現，TNF-α不能誘導并激活NF-κB 信號通路，但是TNF-α在FAS誘導的細胞凋亡調節機制中沒有相應的作用，提示RIP1基因是TNF-α可能是激活NF-κ信號通路中的關鍵因子[10-11]。但是相關臨床學者在研究中認為RIP1基因在TNF-α激活NF-κB信號通路中不是必需的，不管是藥物抑制或者突變失活均會使RIP1基因失去活性，因此在TNF-α誘導下的NF-κB信號通路中活化作用沒有起到任何的作用。Filliol等人報道了小鼠成纖維細胞和肝細胞中的TNF-α激活NF-κB的反應中沒有發現RIP1基因的參與[12]，提示RIP1基因對TNF-α激活的NF-κB信號通路的調控作用可能存在不同組織類型、細胞之間的差異，但是目前尚未有明確的結論分析相關機制，需要進一步研究。

3 RIP1 基因抑制TNF-α 誘導Caspase-8 介導的凋亡信號通路相關性

TNF-α介導的細胞凋亡過程需要Caspase-8進行活化發揮作用，同時TNF-α也是外源性凋亡機制發揮作用的重要因子。TNF-α在TNFR1信號通路中除了通過復合體Ⅰ急性激活并起到促生存、炎癥反應的作用外，TNF-α還可以通過TRADD與RIP1基因、FADD、Caspase-8形成復合體Ⅱa，而復合體Ⅱa一般以酶原的狀態存在于無活性的Caspase-8中，進一步聚集后迅速活化并觸動信號通路下游的其他Caspase因子最終發動聯級反應，通過這一過程啟動細胞凋亡的開始。劉誠林[13]報道了腸上皮細胞單獨敲除RIP1基因小鼠且結果發現腸上皮細胞同時發生了TNF-α誘導、Caspase-8介導的細胞凋亡過程，提示RIP1基因在抑制TNF-α誘導、Caspase-8介導的細胞凋亡過程種占據重要地位。RIP1基因同時具有抑制凋亡進而加速凋亡的作用，表明RIP1基因可能通過不同狀態參與人體中的不同信號通路的調控過程。相關研究發現，當RIP1基因中的Lys377Arg泛素化的重要位點被突變后，RIP1基因能夠從抑制凋亡的信號通路轉變為參與TNF-α誘導、Caspase-8介導的細胞凋亡信號通路，提示泛素化RIP1基因在TNF-α促生存、抗細胞凋亡、炎癥反應信號通路中起重要作用。

4 泛素化狀態對RIP1 基因的調控過程

研究中發現在TNF-α信號通路下對RIP1基因進行5分鐘的誘導后發現RIP1基因迅速聚集到complex I中，此時發現RIP1基因的泛素化受到抑制，同時也進一步抑制了NF-κB的活性[14]，提示TNF-α對RIP1基因泛素化起到決定性作用。一項臨床研究中對TRAF2、TRAF5基因缺陷的大鼠進行分析后發現RIP1基因的泛素化狀態會受到嚴重抑制，另外TRAF2基因可以增加K63對RIP1基因的泛素化鏈接程度，而cIAP1基因和cIAP2基因則對RIP1基因泛素化調節沒有起到任何的作用[15]。

RIP1基因能夠通過8個類型的泛素化鏈來實現泛素化，這8個類型分別是Lys6，Lys11，Lys33，Lys48，Lys27，Lys29， Lys63 、Met1[16]。另外在TNF-α誘導下Lys377是RIP1基因泛素化的唯一結合位點；研究中對Lys48引導泛素化鏈對RIP1泛素化作用進行分析發現，Lys48能夠引起RIP1基因蛋白酶體降解導致調節功能顯著下調[17-18]；Lys63引導的泛素化鏈對RIP1基因的泛素化作用比較特別，它能夠上調RIP1基因調控的信號程度，而Lys48則會降低RIP1基因調控的信號程度。

此外，LUBAC是RIP1基因泛素化鏈形成的重要組成部分，信號通路下游的復合物包括NEMO會與IKKα以及IKKβ進行結合，同時激活細胞中IKKβ的活性，并對NF-κB的活性起到調節作用；臨床學者研究發現K63引導的RIP1基因泛素化在TNFα信號誘導的NF-κB信號通路中沒有發現必要的作用。

5 RIP1 基因參與TNF-α 誘導惡性腫瘤的相關性

RIP1基因可能促進惡性腫瘤疾病的發生和發展，由于RIP1基因蛋白在膠質母細胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌、宮頸癌、膽囊癌中呈現高表達，推測與患者的預后存在密切的相關性[19]。有臨床學者進行了相關報道，RIP1基因蛋白在肝癌患者組織細胞中呈低表達，而RIP1基因高表達可能意味著肝癌患者預后更好[20]，提示RIP1基因在惡性腫瘤組織中可能存在著一定的特異性。RIP1基因能夠通過激活 NF-κB信號通路調節mdm2 并抑制 P53，P53在促進機體惡性膠質瘤發展中起到重要作用，提示RIP1基因激活 NF-κB信號通路后的持續活化是導致惡性腫瘤細胞生長的重要因素。

臨床研究普遍認為TNF-α在促進惡性腫瘤疾病的發生和發展中起著決定性作用，隨著我國基因重組技術的發展為探討RIP1基因在TNF-α信號通路中的作用提供了研究依據，但是惡性腫瘤的發生和發展是一個復雜、動態變化的過程，因此需要進一步收集大量的樣本數據分析 RIP1基因在惡性腫瘤中的作用，而隨著對RIP1基因在惡性腫瘤影響研究的深入分析，能夠為人類惡性腫瘤疾病的治療提供新的參考依據。