二氧化鈦納米棒的制備及抗菌性能研究

(齊齊哈爾醫學院 藥學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

前言

近年來，世界各地嚴重的水體污染為致病菌的滋生和大量繁殖提供了天然的溫床[1]。泛濫的細菌嚴重威脅了人類的生命。因此，抑制致病菌的生長繁殖和傳播，最終殺滅致病菌和病毒已經成為當前一個亟待解決的難題。現有的殺滅細菌的方法主要是通過噴灑藥物的方式，優點是滅菌效果明顯且見效快。但缺點是這種方法很容易對環境產生二次污染，且長期噴灑藥物會使細菌產生耐藥性，從而導致細菌更難被殺滅[2]。因此，如何有效地殺滅細菌成為急需解決的一道難題。

當前，半導體材料為我們提供了一條有效的滅菌途徑[3-4]。當用光照射半導體時，電子(e-)會被激發到半導體的導帶上，從而在價帶上產生空穴(h+)，激發的電子和產生的空穴分別具有還原性和氧化性，它們能與氧氣及水分子反應，生成活性氧物質(ROS)，從而起到殺滅細菌的作用。這種滅菌方式簡單、方便且不會污染環境。在眾多的半導體材料中，納米TiO2半導體材料，由于具有成本低、穩定性好和抗菌活性高等優勢而備受研究者的關注[5]。

通過一種簡單的水熱法得到了TiO2半導體納米棒材料[6]，所制備樣品為銳鈦礦晶相，這有利于發揮其光催化活性。在紫外光的照射下，樣品對革蘭氏陰性菌(綠膿桿菌)具有良好的殺滅效果。

圖1 TiO2納米棒的XRD圖(a)和SEM圖(b)Figure 1 The XRD pattern (a) and SEM image (b) of the TiO2 nanorods.

1 實驗部分

1.1 材料及儀器

Ti(SO4)2、乙二胺、無水乙醇、檸檬酸均為分析純試劑。LB培養基和 MH培養基，磷酸鹽(PBS)緩沖液，綠膿桿菌標準株。

S-4800型日立掃描電子顯微鏡(日立儀器有限公司)，XRD-6000型X射線粉末衍射儀(日本島津公司)，立式壓力蒸氣滅菌器(上海博迅實業有限公司)，1700紫外分光光度計(日本島津公司)，GL-150恒溫培養器(上海銀澤儀器設備有限公司)，DHG-9040A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海三發科學儀器有限公司)。

1.2 二氧化鈦納米棒的制備

0.24 g Ti(SO4)2和0.63 g檸檬酸溶解到14 mL去離子水中。在攪拌下，依次加入8 mL乙二胺和10 mL乙醇。攪拌30 min后轉移到50 mL反應釜中，在180 ℃反應8 h。所得沉淀用無水乙醇和去離子水洗滌幾次。將所得產物在60 ℃干燥箱中干燥12 h，最終得到TiO2納米棒樣品。

1.3 抗菌性能測試

采用微量稀釋法測定樣品的最低抑菌濃度(MIC)。

1)將冷凍保存的綠膿桿菌標準株涂于LB培養基上，37 ℃培養24 h。挑取單克隆菌落接種于MH液體培養基，37 ℃振蕩過夜培養。用MH培養基稀釋過夜菌液至5×105cfu/mL，按90 μL/孔加入到96孔板中；

2)稱取一定量的TiO2粉末于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配制成預定濃度懸浮液，然后在高壓鍋內用120 ℃的飽和蒸汽滅菌 20 min。然后在無菌操作臺上用365 nm紫外光下照射懸浮液2 h，按10 μL/孔加入到菌液中，得到0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.5 mg/mL的TiO2納米棒濃度混合液；然后在37 ℃、180 r/min條件下培養24 h；根據光密度測試數值計算最低抑菌濃度。

1. 4 樣品表征

使用XRD-6000型X射線粉末衍射儀(XRD)測試樣品在2θ為10°～70°之間的衍射峰；用Hitachi S-4800型掃描電子顯微鏡(SEM)觀察樣品的形貌特征；用1700紫外分光光度計在波長為600 nm處測定綠膿桿菌的濃度。

2 結果與討論

2. 1 晶相及形貌分析

眾所周知，TiO2樣品的晶相及形貌影響其性能。而晶相及形貌又決定于反應的溫度和時間。多次實驗結果證明，調節水熱反應的溫度為180 ℃，反應時間為6 h，能夠制備得到合適晶相與完整形貌的TiO2納米棒。如果反應溫度過低，得到的樣品非銳鈦礦晶相，不利于樣品的抗菌性能。而反應時間過短，不能得到完整的納米棒形貌，也會影響樣品的抗菌性能。圖1a所示為最佳反應條件下得到的TiO2納米棒的XRD圖。納米棒樣品的衍射峰與標準銳鈦礦相TiO2(PDF#73-1746)的衍射峰一致，說明所得樣品為銳鈦礦相。由于銳鈦礦相相比金紅石和板鈦礦相TiO2的光催化效果更好，因此有利于樣品發揮光催化抑菌作用。圖1b為所得樣品的SEM圖，可以看出，所得樣品為均一的納米棒，且樣品無團聚，分散性良好，長度450 nm左右。

2.2 樣品抑菌性能分析

選擇綠膿桿菌為目標菌種，在紫外光照射不同濃度TiO2納米棒溶液2 h后，測試樣品對綠膿桿菌的抑菌性能。所得數據見圖2。從圖2可以明顯地看出，以對照樣細菌的存活率100%為參比，隨著TiO2納米棒濃度的增大，綠膿桿菌的存活率逐漸下降，說明經過紫外光照射的TiO2納米棒樣品確實具有良好殺滅細菌的作用。尤其是當TiO2納米棒樣品的濃度達到0.2 mg/mL時，綠膿桿菌的存活率為28.8%，說明在很小劑量TiO2納米棒樣品存在的條件下，就具有很好的滅菌效果。而當樣品的濃度增大到0.5 mg/mL時，綠膿桿菌的存活率僅為4.8%，細菌基本上已經被殺滅。

圖2 綠膿桿菌在不同濃度TiO2納米棒(0～0.5 mg/mL)條件下的存活能力Figure 2 The bacterial viability of P. Aeruginosa exposed to different concentrations (0～0.5 mg/mL) of TiO2 nanorods.

2.3 樣品抑菌性能機理

為了更好地了解樣品的抗菌性能，圖3詳細地描述了TiO2納米棒的光催化滅菌機理。在365 nm紫外光照射下，光生電子從TiO2納米棒的價帶激發到其導帶，這些電子會被TiO2納米棒表面吸附的O2捕獲形成超氧自由基(·O2-)和羥基自由基(·OH)。與此同時，留在TiO2納米棒的價帶光生空穴會和溶液中的H2O和 OH-反應生成羥基自由基(·OH)。這些活性氧物質(ROS)會攻擊細菌并最終破壞細菌的細胞壁，并且能夠分解組成細胞的物質，從而使細菌死亡，起到殺滅細菌的作用。

TiO2+ hv→h++ e-

H2O + h+→H++·OH

OH-+ h+→·OH

O2+ e-→·O2-→·OOH → H2O2→·OH

圖3 TiO2納米棒的光催化滅菌機理圖Figure 3 Mechanism of photocatalytic bacterial killing of TiO2 nanorods.

3 結論

通過一種簡單的水熱法制備了形貌均一、單分散的TiO2納米棒樣品。所得樣品不需經過煅燒處理就為銳鈦礦相。在365 nm紫外光照射后，納米棒樣品對綠膿桿菌具有良好的殺滅效果，且隨著所用樣品濃度的增大，滅菌效果也逐漸增加。當樣品的濃度為0.5 mg/mL時，TiO2納米棒對綠膿桿菌的抑菌率達到95.2%，這為制備具有良好抗菌性能的納米材料提供了一條可行的途徑。