京尼平苷對老年大鼠軟骨細胞凋亡的保護作用及機制

李皓 李仁嵩 肖志剛 陳森

(武漢市武昌醫院骨科，湖北 武漢 430063)

骨關節炎是以關節軟骨退變，累及包括滑膜、軟骨、軟骨下骨、韌帶、半月板等整個關節的慢性退行性疾病。骨關節炎的發病機制目前為止尚無定論，但可以肯定的是：骨關節炎是多因素共同作用的結果。研究證實：骨關節炎患者軟骨細胞存在過度凋亡，相反，抑制軟骨細胞凋亡可延緩骨關節炎的進展〔1〕。因此，軟骨細胞凋亡與骨關節炎密切相關。京尼平苷具有多種生物學效應，如抗炎鎮痛和抗細胞凋亡。有研究表明，京尼平苷可以保護硝普鈉(SNP)誘導的軟骨細胞凋亡，但其作用機制尚未完全揭示〔2〕。本研究旨在探討京尼平苷對SNP誘導大鼠軟骨細胞凋亡及骨關節炎的保護作用及機制。

1 材料和方法

1.1材料 實驗大鼠：取8周齡Sprague-Dawley(SD)大鼠，由武昌醫院動物實驗中心供給〔實驗動物質量合格證許可證號：SCXK(京)2016-0004〕，雌雄不限。實驗過程符合2006版《關于善待實驗動物的指導性意見》的標準。

主要試劑：京尼平苷(上海純優生物有限公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；Ⅱ型膠原酶(Sigma公司)；0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(武漢博士德生物公司)；杜爾伯科極限必需培養基(DMEM)/F12培養基(美國Gibco公司)；SNP(華潤雙鶴藥業股份有限公司)；Cell counting kit-8(CCK-8)試劑盒(日本Dojindo公司)；D-Hank平衡液(杭州吉諾生物醫藥技術有限公司)；SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德生物公司)；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量測定試劑盒(北京普利萊生物有限公司)；二氨基聯苯胺(DAB)染色試劑盒(武漢博士德生物公司)；二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)；Hoechst34580試劑盒(日本Dojindo公司)；羅丹明(Rho)123染液(日本Dojindo公司)；4%多聚甲醛溶液(武漢博士德生物公司)；其他常用試劑為分析純。

1.2實驗方法

1.2.1軟骨細胞的提取及培養 取8周齡的SPF級SD大鼠,頸椎脫臼處死后，游離膝關節，75%酒精浸泡10 min；無菌條件下帶入超凈工作臺，初步游離雙側膝關節軟骨，無菌紗布去除周圍軟組織，將軟骨置于金屬器皿中；用11號手術刀片將其切成約1.0 mm3大小，置入5 ml無菌離心管中，往離心管中加1∶5體積比的胰酶，置于恒溫搖床中(溫度37℃，轉速100 r/min)60 min，然后1 000 r/min離心5 min；棄上清，加入1∶5體積比的0.25%Ⅱ型膠原酶，置于恒溫搖床中(溫度37℃，轉速100 r/min)180 min，1 000 r/min離心5 min；離心后棄上清，加2 ml含有10%胎牛血清(FBS)、100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的DMEM/F12培養基,將其混勻；20目尼龍網篩過濾，吸出后加入培養瓶中，再加培養基至5 ml，倒置顯微鏡下觀察可見軟骨細胞。

1.2.2SNP誘導軟骨細胞凋亡模型的建立 取第二代軟骨細胞，用0.02%EDTA(含0.25%胰蛋白酶)消化液消化，制成細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加含FBS的DMEM/F12培養基稀釋；將稀釋后的細胞懸液接種于6孔板中，置于37℃細胞培養箱(含5%CO2)內培養，次日換液；當軟骨細胞鋪滿培養板80%左右時，用含FBS的DMEM/F12培養基再次換液，同時加入SNP溶液，設對照組、SNP終濃度0.75、1.00、1.50、2.00 mmol/L 5組細胞，每組5個復孔，37℃培養24 h；光鏡下觀察軟骨細胞凋亡情況，保存圖片，記錄SNP誘導凋亡的最適終濃度(據實驗結果為1.00 mmol/L)，為后續實驗提供參考。

1.2.3CCK-8細胞增殖抑制試驗 選取狀態良好的二代軟骨細胞，消化液將細胞制成懸液，離心5 min(1 000 r/min)；倒掉上清液，加入DMEM/F12(含10%FBS)培養基；細胞計數板計數后，按濃度稀釋，將細胞以1×105個/ml的密度種于96孔板(每孔100 μl)，軟骨細胞貼壁后，饑餓法(無血清培養基)培養24 h；加入京尼平苷，終濃度分別為20、40、80、160 μg/L，每組設6個復孔，置于CO2培養箱培養24 h。對照組加入等量PBS；每組設置5個復孔。96孔板中，每孔滴入CCK-8溶液10 μl，1 h后酶標儀檢測吸光度A值。計算方法參照酶標儀說明書，即：細胞活力(%)=(待測組-空白組)/(標準組-空白組)×100%，重復3次。

1.2.4Hoechst34580觀察細胞核形態 實驗分四組，對照組、1 mmol/L SNP組、80 μg/L京尼平苷組，160 μg/L京尼平苷組，兩個濃度京尼平苷組也分別加用1.0 mmol/L SNP。將含4組細胞的6孔板置于37℃培養箱(含5%CO2)中避光培養24 h；棄上清，PBS洗滌3次，固定30 min(4%多聚甲醛固定液)；小心倒掉固定液，PBS 2 ml洗滌細胞3次，每次5 min；加Hoechst34580染液500 μl(終濃度為5 μg/ml)，37℃避光孵育30 min；棄Hoechst34580染液，加入2 ml PBS洗滌細胞3次，每次5 min；倒置熒光顯微鏡觀察軟骨細胞核形態(激發波長355 nm、發射波長465 nm)。

1.2.5Rho123檢測線粒體膜電位 實驗分組同1.2.4。棄細胞培養基，加入2 ml DMEM/F12細胞培養基；將6孔板置于37℃培養箱(含5%CO2)中避光培養；滴加Rho123染液，調整終濃度至10 μmol/L，37℃避光放置30 min；棄Rho123染液，加入2 ml PBS緩沖液洗滌6孔板細胞2次，每次5 min；倒置熒光顯微鏡下觀察軟骨細胞，Rho123染色陽性細胞顯示綠色熒光(激發波長488 nm、發射波長530 nm)。

1.2.6流式細胞檢儀檢測細胞凋亡 實驗分組同1.2.4。將含4組細胞的6孔板置于37℃培養箱(含5%CO2)中培養。24 h，錫紙包裹，避面曝光；將每孔上清液收集，再用0.02%EDTA(0.25%胰蛋白酶)消化并收集細胞懸液；1 000 r/min離心5 min，收集上清，加入預冷PBS稀釋細胞，收集細胞；將每孔所有液體混合，1 000 r/min離心5 min，加入凋亡檢測試劑盒內的結合緩沖液500 μl于離心收集的細胞內，將細胞懸液輕輕混勻，至于冰上放置30 min；分別加5 μl AnnexinV-FITC和10 μl PI，室溫避光孵育5 min；樣本上機檢測，記錄保存相關結果。

1.2.7Western印跡 實驗分組同1.2.4。分別調好終濃度，置于37℃培養箱內培養24 h。按照BCA蛋白濃度檢測試劑盒說明書，將試劑盒中A液和B液按1∶50的比例充分混勻后配成工作液；取10 μl經三蒸水溶解的蛋白標準品，稀釋至100 μl使其終濃度達到0.5 mg/ml。再將標準品按0、1、2、4、8、16、20 μl的量分別加入到酶標板上，然后用三蒸水把各個孔補足到20 μl；再在各個孔中加入200 μl前面配好的工作液，37℃恒溫烤箱中放置40 min后使用酶標儀測定565 nm波長處的吸光度OD值。根據前面所得的標準曲線計算公式計算蛋白質濃度。然后用裂解液將各個蛋白樣品的濃度調成一致。使用電化學發光法(ECL)化學發光試劑，在室溫下孵育PVDF膜后放入暗盒中，暗室紅燈下曝光1 min，然后顯影，定影；對膠片進行拍照，再用軟件分析條帶的灰度值。

1.3統計學方法 應用SPSS17.0軟件行單因素方差分析，Graphpad Prism5軟件行統計分析和繪圖。

2 結 果

2.1不同濃度SNP誘導軟骨細胞凋亡 SNP終濃度0.75 mmol/L組見少量細胞死亡；1.00 mmol/L組死亡約40%；1.50 mmol/L組死亡約50%；2.00 mmol/L組死亡約80%。死亡過多，對細胞的檢測及蛋白的測量均有影響；死亡過少，不能體現組間差異，因此，誘導凋亡的適宜濃度為1.00 mmol/L。見圖1。

2.2不同濃度京尼平苷對軟骨細胞增殖的影響 對照組存活率(100±1)%，20 μg/L京尼平苷組為(98±3)%，40 μg/L組為(97±5)%，80 μg/L組為(99±4)%，160 μg/L組為(96±2)%，組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。表明不同濃度京尼平苷對軟骨細胞增殖抑制效果不明顯。

2.3京尼平苷對SNP誘導軟骨細胞凋亡細胞核形態的影響 對照組軟骨細胞核均染，核圓，無固縮及裂解；經1 mmol/L SNP誘導的軟骨細胞數目明顯減少，可見核固縮與核碎裂的細胞，偶見凋亡小體；經80 μg/L京尼平苷作用的SNP誘導軟骨細胞核固縮、核碎裂與1 mmol/L SNP組比較有所降低；經160 μg/L京尼平苷作用的SNP誘導軟骨細胞核固縮與核碎裂細胞數量有所減少，核固縮與核碎裂與1 mmol/L SNP組及80 μg/L京尼平苷組比較有所降低。由此可見京尼平苷對SNP誘導軟骨細胞凋亡有一定保護作用。見圖2。

2.4京尼平苷對SNP誘導軟骨細胞凋亡細胞線粒體膜電位的影響 對照組軟骨細胞線粒體染色為綠色熒光，清晰、明亮，表明線粒體膜電位正常；1 mmol/L SNP組軟骨細胞線粒體染色細胞綠色熒光強度明顯減弱，表明線粒體膜電位明顯降低，膜完整性受到破壞；80 μg/L京尼平苷組軟骨細胞線粒體染色綠色熒光強度較1 mmol/L SNP組強；160 μg/L京尼平苷組軟骨細胞線粒體染色綠色熒光強度較1 mmol/L SNP組及80 μg/L京尼平苷組強，但較對照組軟骨細胞熒光強度差，表明線粒體膜電位損傷明顯恢復。見圖3。

圖1 不同濃度SNP誘導軟骨細胞凋亡(×100)

圖2 京尼平苷對SNP誘導軟骨細胞凋亡細胞核形態的影響(×100)

圖3 京尼平苷對SNP誘導軟骨細胞凋亡細胞線粒體膜電位的影響(×100)

2.5京尼平苷對SNP誘導軟骨細胞凋亡的影響 1 mmol/L SNP組凋亡明顯〔凋亡率(49.32±4.23)%〕；80 μg/L京尼平苷組軟骨細胞凋亡次之〔凋亡率(27.97±4.35)%〕；160 μmol/L京尼平苷組軟骨細胞凋亡〔凋亡率(22.92±5.24)%〕較1 mmol/L SNP組及80 μg/L京尼平苷組少，但仍高于對照組〔凋亡率(7.52±1.01)%〕，經統計學分析，4組細胞凋亡差異有統計學意義(P<0.05)。

2.6各組軟骨細胞內iNOS、Bax蛋白表達的影響 對照組細胞很少表達iNOS、Bax蛋白；1 mmol/L SNP組iNOS、Bax蛋白表達最明顯(P<0.05)；80 μg/L京尼平苷組iNOS、Bax蛋白表達較1 mmol/L SNP組低(P<0.05)，但高于80 μg/L京尼平苷組(P<0.05)。見圖4，表1。

圖4 京尼平苷對SNP誘導軟骨細胞凋亡軟骨細胞內iNOS、Bax蛋白表達的影響

表1 不同組間iNOS和Bax的表達情況

與1 mmol/L SNP組比較：1)P<0.05；與80 μg/L京尼平苷組比較：2)P<0.05

3 討 論

提取軟骨細胞的常用方法包括組織塊法、酶消化法。本實驗采用酶消化法從8周齡SD大鼠膝關節軟骨中分離出細胞，經蛋白聚糖和Ⅱ型膠原免疫組化的方法證實體外培養細胞為軟骨細胞。對于體外軟骨細胞凋亡模型的建立，不同藥物、不同濃度的誘導方法均有報道〔3〕。本研究采用終濃度為1 mmol/L的SNP誘導軟骨細胞凋亡，效果明顯，符合實驗要求。用SNP誘導軟骨細胞凋亡的文獻并不少，且誘導凋亡的SNP終濃度報道不一致〔4〕。其原因可能為：(1)不同研究者對凋亡的需求程度不同，例如半數致死濃度和75%致死濃度肯定存在差異。(2)不同實驗室、不同研究人員體外培養的軟骨細胞存在差異。但SNP構建體外軟骨細胞凋亡模型，效果明顯是大家的共識。軟骨細胞凋亡與骨關節炎之間關系十分密切。骨關節炎軟骨中軟骨細胞凋亡率明顯高于正常關節軟骨，骨關節炎累及區域軟骨細胞凋亡也高于非累及區域，軟骨細胞凋亡的分布區域與荷載區域相關。軟骨起緩沖作用，最先累及淺層或淺中層，因此，淺層或淺中層軟骨細胞較深層凋亡明顯。以上跡象表明，軟骨細胞凋亡與骨關節炎呈時間、空間相關。有學者經流式細胞技術證實正常關節軟骨細胞凋亡率為4.8%，而關節炎中軟骨細胞凋亡率為22.3%〔5〕；還有研究表明骨關節炎軟骨中細胞凋亡率為4%～14%，而健康人群骨關節炎軟骨中細胞凋亡率不超過2%〔6〕。盡管骨關節炎中軟骨細胞凋亡率存在差異，不排除不同方法檢測細胞凋亡的靈敏度和特異度存在差異，也有可能不同物種、不同人群、不同區域的結果存在差異。京尼平苷是梔子的主要藥效成分之一，化學分子量為388.37，屬于環烯醚萜葡萄糖苷類物質；具有抗炎鎮痛、緩瀉利膽、促軟組織損傷愈合、抗凋亡及抑胃酸分泌等作用。目前治療骨關節炎的藥物主要分為緩解癥狀和改善病情兩大類〔7〕。京尼平苷的多重功效對骨關節炎是否具有治療價值，是個值得探索的問題。本研究嘗試將京尼平苷應用于體外凋亡的軟骨細胞，結果顯示京尼平苷具有抗SNP誘導軟骨細胞凋亡的作用。Bax蛋白具有促凋亡作用，處于凋亡信號通路的下游〔8〕，其表達下降意味著細胞凋亡事件減少。iNOS表達下降意味著通過PI3K-Akt信號途徑產生的NO減少，依賴NO的cGMP-PKG誘導細胞凋亡事件也相應減少。一氧化氮合酶分為神經元型(nNOS)、內皮型(eNOS)和iNOS三種，正常體內存在eNOS及nNOS兩種一氧化氮合酶，生理功能各異，因此稱為結構型NOS(cNOS)。這兩者的活性受細胞內Ca2+濃度的調節〔9〕。iNOS一般不表達，但在某些藥物或細胞因子的刺激下可以促使其表達。一旦iNOS表達，因其活性為非Ca2+離子依賴性，故可持續表達。iNOS的持續表達可使NO水平升高，促使各種細胞因子分泌，上調基質金屬蛋白酶(MMP)的基因表達及其活性，抑制膠原蛋白的合成、促進膠原蛋白的分解及影響軟骨的營養交換從而損害軟骨細胞及軟骨基質〔10～12〕。本研究中京尼平苷使SNP誘導軟骨細胞凋亡的軟骨細胞內iNOS蛋白水平下降，似乎可以解釋上述現象。因此，京尼平苷對SNP誘導大鼠軟骨細胞凋亡有一定的保護作用，其機制可能是通過降低軟骨細胞iNOS的表達，從而達到抑制軟骨細胞凋亡的效果。