豬精液超低溫冷凍保存研究進展

吳 夢，劉雪芹，劉子嘉，肖普英，丁玉春,3,4，劉作華,3,4*，葛良鵬,3,4*

（1.重慶市畜牧科學院，重慶 402460；2.養豬科學重慶市市級重點實驗室，重慶 402460；3.農業部養豬科學重點實驗室，重慶 402460；4.重慶市醫用動物資源開發與轉化應用工程技術中心，重慶 402460）

豬的遺傳資源保存是實驗用豬作為模式動物開發應用的基礎性保障。豬精液保存是豬遺傳資源保存的重要途徑，與卵母細胞、受精卵、胚胎的低溫保存相比，精液低溫保存技術方便、快捷且更加經濟。不僅如此，精液低溫冷凍保存在建立動物精液基因庫、提高優良種公豬的利用率、開展國際間種質資源交流、防止疾病傳播等方面有著重要意義。但與鮮精保存相比，冷凍解凍后的精子活率和生育率較低，極大地限制了豬精液冷凍保存技術的推廣應用。本文從豬精液冷凍保存的研究概況、冷凍損傷機理及豬精液冷凍保存影響因素方面的進展進行綜述，為豬精液超低溫冷凍保存研究提供新的思路和方法。

1 豬精液冷凍保存的研究概況

Polge 等[1]最初采用牛精液冷凍方法來冷凍豬精液，雖然解凍后的精子具有一定活力，但沒有受精能力。Polge 等[2]首次采用外科手術法將解凍后的精子直接注入受體母豬輸卵管，獲得了83%的受精卵。自20 世紀70 年代以后，豬冷凍精液的研究發展較快，陸續有報道利用凍精成功獲得存活仔豬。Pursel 等[3]和Westendorf 等[4]分別以顆粒和細管冷凍方法成功保存了豬精液。此后，為了把豬的精液冷凍技術應用到養豬生產實踐中人們做出了大量工作，并對操作程序進行了不斷優化。20 世紀80 年代初至90 年代末，研究人員主要采用甘油（GLY）作為冷凍保護劑，通過優化GLY 濃度、采用不同劑型和不同冷凍速率等探索提高豬精子冷凍效率的方法[5-8]。隨著對精液冷凍機理研究的深入，研究人員開始發現并嘗試各種新型精液稀釋液，其中研究較多的是低密度脂蛋白（LDL）、雙糖（乳糖、蔗糖、乳果糖、海藻糖或蜜二糖）、甲基-β-環糊精載膽固醇（CLC）、谷胱甘肽、過氧化氫酶等，同時配合優化后的冷凍-解凍方法來降低對精子活率和受精率的影響，并取得了一定進展[9-15]。

國內豬精液冷凍保存技術研究起步較晚，于1974年才開始對豬精液冷凍保存技術開展研究，20 世紀80年代開始從國外引進生產冷凍精液的設備和技術。吳石堅等[16]統計了1981—1988 年豬冷凍精液人工授精（AI）的推廣與應用，總計配種受體母豬61 481 頭，雖然第一情期平均受胎率為75.97%，但產仔率仍然處于較低水平。從20 世紀90 年代開始，許多研究人員從冷凍保護劑、稀釋液、凍精劑型、解凍液等多方面進行了研究和優化，取得了一定成績，但對精子損傷機理、冷凍-解凍機理、冷凍-解凍對精子的影響等諸多方面尚不完全清楚，仍處于實驗階段[17-22]。近年來，由于氧化性損傷對精子損傷機理研究的不斷深入，國內外研究者開始轉向研究抗氧化劑對豬精液冷凍保存的影響，以期在冷凍-解凍過程中提高精子活率，除了添加谷胱甘肽、過氧化物酶、維生素E 等添加劑外，還采用一些植物性抗氧化劑，例如黃芩素、黃芪多糖、紅景天多糖、芝麻酚等，雖然這些抗氧化劑能對豬精子產生不同程度的抗氧化作用，但就目前的研究結果來看，冷凍精液與鮮精相比，在受胎率和窩產仔率方面仍存在較大差距[23-27]，隨著對豬精子冷凍因素的深入分析，冷凍對豬精子形態結構、蛋白質和酶活力等冷凍損傷機理研究的不斷深入，更多的冷凍保護劑在不斷地被開發和應用，因此還需要不斷探索，建立高效穩定的豬精液冷凍保存方法，并將其應用于生產實踐中，提高種豬繁殖力和豬種資源利用率。

2 豬精液冷凍損傷機理

2.1 物理性損傷 物理性損傷是指精子細胞水分形成的冰晶，其體積增大且形狀不規則，由于冰晶的擴展和移動，對精子質膜和細胞內部結構造成機械性損傷，導致細胞死亡。在緩慢降溫的條件下，冰晶形成的溫度范圍為-60～-10℃，-25～-10℃時形成冰晶最多，且降溫越緩慢冰晶形成越多，對精子損害越大。因此，在精液冷凍過程中要盡量避開-60～-10℃這個危險溫度區，才利于精液長期保存。為了減少或避免發生冰晶化，必須快速降溫越過產生冰晶的溫度范圍，并保存在冰晶不再形成的超低溫條件下，如-196℃的液氮或-269℃的液氦[28]。當然，冷凍速率并不是越高越好，如果冷凍速率過高，細胞內水分不會完全流出，在細胞內凍結，而細胞質中冰晶的形成最終導致冷凍損傷。Byrne 等[29]將5℃平衡后精液直接放入液氮蒸汽中，結果顯示精子活力明顯低于經一定降溫速率冷凍的精子。除了冷凍時需要盡量減少冰晶形成外，解凍也同樣面臨-60～-10℃的危險溫度區間，因此，快速解凍同樣非常必要。Johnson 等[30]以GLY 為例，在保證冷凍后豬精子的活率和頂體完整性上，得到的最佳冷凍組合：3%的GLY、30℃/min 的降溫速率和1 200℃/min 的解凍速率。因此，在豬精液冷凍過程中，無論是降溫還是升溫都應采取快速處理，且配合適宜濃度的保護劑，以避免危險溫度區對精子的損傷。

2.2 化學性損傷 化學性損傷是指不斷降溫過程中細胞外液首先形成一小部分冰晶，使細胞外液滲透壓逐漸增大，而精子細胞內的水分由內向外流出，導致細胞內的溶質濃度和滲透壓增高，精子細胞嚴重脫水發生不可逆的化學性損傷而死亡。研究表明，在精液稀釋液中添加一定濃度的GLY、二甲基亞砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）等抗凍保護劑能盡量避免產生冰晶，增強精子的抗凍能力。但GLY、DMSO、DMF 等抗凍保護劑濃度過高同樣會對精子產生毒害作用，包括引起精子頂體、頸部及尾部的損傷及破壞某些酶類等[31]。Pinho 等[32]研究發現，將GLY 與DMF 和二甲基乙酰胺（DMA）的組合作為抗凍保護劑冷凍豬精液后精子質量要明顯好于單獨使用GLY 組。因此，選擇合適的抗凍保護劑組合以及濃度對精子冷凍效率至關重要。

2.3 氧化性損傷 氧化性損傷是指發生的氧化反應對精子的結構和活性造成的損傷。在正常狀態下，活性氧（ROS）的生成和消除是動態平衡的，并且適量ROS 對機體的生理活動也是必須的。但在精液冷凍過程中，由于低溫對精子的影響，精子細胞內產生大量ROS，而細胞內用于消除ROS 的抗氧化酶活性大大降低，造成ROS 在細胞內過量堆積，對精子造成不可逆的損傷[33-36]。研究表明，ROS 通過引發精子膜上的多聚不飽和脂肪酸發生過氧化反應，產生大量脂類過氧化物，從而使精子膜出現不可逆性破壞并消失，抑制精子的運動功能[35]。由于豬精子膜上的不飽和脂類含量較其他物種高，更容易發生氧化反應，導致精子冷凍質量低下，因此在豬精液冷凍過程中，更應注意氧化性損傷對精子質量的影響。

3 豬精液冷凍保存的影響因素

3.1 精液稀釋液 豬精液稀釋液是精子冷凍保存過程中的保護劑，對精液的冷凍效果起決定性作用。由于冷凍方法和冷凍劑型的不同，其冷凍稀釋液的組成成分也不盡相同，因此目前冷凍稀釋液的種類繁多。豬精液稀釋液主要分為含緩沖鹽和不含緩沖鹽的的冷凍稀釋液，含緩沖鹽的冷凍稀釋液主要包括甘氨酸-磷酸和葡萄糖-磷酸[37]、卵黃-葡萄糖-檸檬酸[38]、Beltsville F3（BF3）[39]、Tes-三羥甲基氨基甲烷（tris）-果糖-檸檬酸-卵黃（TEST）[40]、Beltsvle F5（BF5）[3]、Tris-葡萄糖-乙二胺四乙酸-卵黃[41]等；不含緩沖鹽的冷凍稀釋液主要包括卵黃-葡萄糖[2]、卵黃-蔗糖[42]及卵黃-乳糖[4]等。研究表明，精子在代謝過程中產生的一些物質會使稀釋液的pH 發生變化，對精子產生不利影響，而含緩沖鹽的冷凍稀釋液中的檸檬酸、Tris 等緩沖物質可調節精液適宜的pH為7.0～7.5，對精液有一定的保護作用[43]。

豬精液稀釋液的另一重要組成成分是冷凍保護劑，按其特性分為滲透性和非滲透性冷凍保護劑。滲透性冷凍保護劑因其相對分子質量較小，容易透過細胞膜到達細胞內部，也被稱為細胞內液冷凍保護劑，其親水性強、易與水分子結合，能在水結晶過程中限制和干擾水分子晶格的排列，抑制水分子形成冰晶。滲透性冷凍保護劑主要包括GLY、DMSO、乙二醇（EG）、丙二醇（PROH）、甲醇（MeOH）、DMF、DMA 等。GLY 是目前應用最廣泛的冷凍保護添加劑之一，它能在精液冷凍降溫時增加精子細胞內部的滲透壓，減少精子由于失水過多而產生細胞皺縮、細胞膜結構的不可逆性破壞，從而減緩細胞膜通透性的改變，減少精子死亡。同時，GLY 含有3 個羥基，能夠和細胞內的水分結合，使精子在降溫過程中減少細胞內部冰晶的形成，減輕精子細胞受到的物理性損傷[31]。Zeng 等[44]研究結果顯示，2%和3%的GLY 具有最佳的抗細胞凋亡作用，且B 細胞淋巴瘤/白血病-2 及其同源蛋白（Bcl-2/Bax）、腫瘤壞死因子、神經生長因子受體跨膜蛋白及其配體（Fas/FasL）的表達與精子凋亡有很強的相關性。李大吉[45]研究表明，GLY 濃度在2%～4%時凍融豬精液的精子活率和頂體完整性明顯優于高濃度組。非滲透性冷凍保護劑不能自由通過細胞膜，因此又叫細胞外液冷凍保護劑，其主要特性是溶于水，但不能進入細胞，能誘導胞外冰晶網格及水分子籠型結構的形成，減輕細胞物理性損傷。非滲透性冷凍保護劑分為低分子質量和高分子質量2 種，低分子質量非滲透性冷凍保護劑主要通過改變細胞外液滲透壓，促使細胞在冷凍時脫水，而在解凍時防止水分快速進入細胞，降低對細胞的損傷，其主要包括葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖、乳糖等，不同濃度的幾種糖類混合使用對精液保護效果更好。潘紅梅等[46]將3 種雙糖（乳糖、蔗糖和海藻糖）以不同比例組合添加于豬精液冷凍保護液后，發現以33.3%的乳糖和66.7%的蔗糖的組合對豬精液冷凍保護的效果最好。Gómez 等[47]研究了3 種單糖和5 種雙糖對精液冷凍效果的影響，結果顯示，單糖組中葡萄糖的效果最好，雙糖組中海藻糖效果最好，但海藻糖效果還是明顯優于葡萄糖。高分子質量非滲透性冷凍保護劑主要通過促進細胞玻璃化形成，減少冷凍和解凍過程致死性冰晶的生成，穩定細胞膜，同時部分替代滲透性冷凍保護劑以減輕冷凍液的毒性，其主要包括葡聚糖、聚蔗糖、聚乙烯乙二醇和聚乙烯比咯烷酮（PVP）等。聚蔗糖在人胚胎和牛胚胎保存上已經取得了成功，并廣泛應用于多種哺乳動物卵母細胞的玻璃化冷凍保存[48]。Checura 等[49]研究在稀釋液中加入不同濃度的PVP 對凍后牛胚胎發育的影響，結果顯示添加6%和20%的PVP 取得了較高的囊胚率。目前高分子質量非滲透性冷凍保護劑主要用于卵母細胞及胚胎的玻璃化冷凍保存，在豬精液中的應用還比較少見。

3.2 冷凍劑型 在豬精液冷凍劑型方面，最初采用玻璃瓶、玻璃試管加入稀釋液進行冷凍保存。目前，在豬精液冷凍保存研究中，分別采用顆粒、5 mL 大型細管、5 mL 不同類型塑料袋、4～5 mL 鋁箔袋、1.7～2.0 mL 扁平細管、0.5 mL 中型細管和0.25 mL 微型細管等方法進行保存，這些保存方式有著各自的優缺點。Clarke 等[50]證實，顆粒法冷凍精液在冷凍和解凍時容易交叉污染，冷凍顆粒的劑量不準確，在使用便利性上存在缺陷，且解凍后精子受精率較差，因此這一包裝類型在生產實踐中應用較少。李林林[51]采用0.25 mL 微型細管、5 mL 大型細管冷凍豬精液，發現兩者在凍后精子活力和活率的差異不顯著，可在生產實踐中推廣使用。Eriksson 等[52]用5 mL 塑料袋冷凍豬精液，凍后精子的質膜完整率平均為60%，精子活率為50%左右，產仔率達73%，平均窩產仔數達10.7 頭。Waide[53]研究結果顯示，使用5 mL 鋁箔袋冷凍豬精液，采用快速冷凍法的精子活率明顯高于慢速冷凍法，且平均產仔率為72.9%，平均窩產仔數為8 頭。Barbas 等[54]研究結果顯示，扁平細管或5 mL 塑料袋在受精能力、輸卵管富余精子方面比大型細管有明顯優勢。殷方芝[55]研究發現，5 mL 大型細管解凍后的精子活力、活率、質膜完整性都低于0.25 mL 微型細管，但差異不顯著。Bwanga 等[56]利用程序化冷凍儀進行冷凍保存，解凍后0.25 mL 微型細管的精子活率明顯高于5 mL 大型細管，但兩者的頂體完整性差異不明顯。劉德玉等[57]采用3 種細管類型（0.25、0.5、5 mL）研究了對不同公豬精液冷凍效果的影響，結果顯示，相同劑型下，除0.25 mL 微型細管存在品種效應外，其余2 種劑型在解凍后精子頂體完整率無顯著差異，0.5 mL 中型細管的精子活力最好，5 mL 大型細管的精子畸形率及頂體完整性最好。薛琦[58]研究表明，0.5 mL 中型細管解凍后精子活率顯著高于0.25 mL 微型細管。從生產實際來說，采用大劑量包裝類型可以減少精液分裝及解凍的時間，提高AI 效率，但由于大劑量包裝在冷凍過程中冷凍速率不一致，精子受冷不均勻，導致解凍后精子質量下降。從低溫生物學技術來說，小劑量包裝類型有較大的表面積/容積比，可以達到較好的冷凍和解凍速率，且適合超低溫冷凍保存的形狀可以提高精液冷凍質量，但由于單根冷凍保存劑量小，豬AI 一次需要的精液數量非常大，因此不利于生產實踐的推廣應用。目前就國內外應用來看，為了保證冷凍精子的質量，豬精液冷凍大多還是以0.25 mL 微型細管、0.5 mL 中型細管和5 mL 大型細管為主。

3.3 冷凍方法 在豬商業化精液冷凍生產中，主要采用的方法有Beltsville 冷凍法和改良Westendorf 冷凍法。Beltsville冷凍法是將采集后的精液經過兩步法進行稀釋，稀釋后的精液采用顆粒法進行冷凍，制成0.15～0.2 mL 顆粒凍精，最后投入液氮（-196℃）貯存。解凍時，從液氮中取出冷凍精液，置于室溫3 min，然后迅速投入裝有BTS 解凍液的燒杯中（50℃，20 s）進行解凍。Westendorf 冷凍法是將采集后的精液經過三步法進行稀釋，稀釋后的精液分裝在0.5 mL 中型細管、5 mL 大型細管等不同劑型里，利用程序化冷凍儀，按照初始溫度為5℃，以3℃/min從5℃降至-5℃，在-5℃條件下保持1 min 結晶，然后以50℃/min 從-5℃降至-140℃，最后投入液氮（-196℃）貯存。解凍時，從液氮中取出冷凍精液，迅速在恒溫水浴鍋中解凍，不同劑型解凍條件有所差異：0.25 mL微型細管（37℃，30 s）0.5 mL 中型細管（50℃，12 s 或37℃，20 s），5 mL 大型細管（50℃，40 s），5 mL 扁平袋（50℃，13 s），然后在室溫下用預熱的BTS 解凍液進行相應濃度稀釋。其中，Beltsville 冷凍法適用于豬顆粒凍精生產，Westendorf 冷凍法更適用于豬細管凍精的生產。雖然2 種豬精液冷凍法在生產實踐中已被認作是標準方法，但在冷凍-解凍方法及解凍液等方面仍有改進空間。周鑫等[59]采用不同冷凍方法和解凍液優化了豬精液冷凍保存的方法，結果顯示，與液氮顆粒和液氮細管法相比，采用顆粒法冷凍結合葡萄糖-乙二胺四乙酸解凍液解凍是最優的冷凍方法，使用該方法冷凍、解凍的豬精液進行體外受精后的胚胎發育率與鮮精沒有顯著差異，同時體外受精后囊胚率與新鮮精液無顯著差異。梁鴻斌等[60]在冷凍速率和解凍溫度兩方面優化了豬精液冷凍的方法，結果表明，采用-120℃平衡10 min冷凍，37℃，30 s 水浴解凍方法更為適合0.25 mL 微型細管豬冷凍精液解凍。查星琴等[61]研究不同解凍液配方和解凍方法對版納微型豬近交系（BMI）豬精液冷凍的影響，對比解凍后的精子活力、質膜完整率和頂體完整率顯示，2%或3%的GLY 作為抗凍保護劑時，Ⅰ號解凍液解凍40℃、6 s 或50℃、6 s 水浴解凍效果最好。隨著冷凍方法各個環節的不斷優化，細管凍精解凍后精子活率已與顆粒凍精相當，加之采用細管凍精操作方便且不易交叉污染，因此，改良Westendorf 冷凍法已逐漸代替顆粒凍精并廣泛應用于生產實踐中。

4 展 望

盡管近年來豬精液超低溫冷凍保存技術的研究取得了一定成績，但與牛、馬等家畜相比仍有很大差距，其主要原因在于：豬一次射精量大，約200～300 mL，精液對外界溫度非常敏感，極其不耐凍；其次，豬是多胎動物，需要多達20 億～50 億枚凍精才能滿足1 次配種，這給大劑量豬精液冷凍保存帶來了極大困難；再者，一頭種公豬的經濟價值遠沒有種公牛高，且使用鮮精的繁殖效果比凍精更好。

根據最新報道顯示，河北省廊坊市研發的豬冷凍精液技術在全國率先實現了冷凍精液配種與鮮精配種同等效果的繁育水平，凍精解凍后精子活力為74%～87%，平均受胎率在90%以上，產仔數已接近常溫精液水平。盡管如此，由于豬冷凍精液所需儀器設備昂貴及操作程序復雜、對操作者技術和熟練程度有較高的要求、液氮保存和運輸困難等各方面原因，豬精液超低溫冷凍保存技術仍然未建立一套完整、科學的冷凍程序和保存體系，無法在生產中廣泛應用。因此，針對豬精液冷凍保存技術目前存在的問題，還需從以下幾個方面繼續努力：第一，建立一套完整的豬精液冷凍保存技術體系，并配套快速、簡便、準確的精子質量評估方法；第二，研發高通量大體積、自動化的豬精液凍存設備，制定標準化操作規程；第三，建立豬精液種子保存平臺，為我國實驗用豬、地方豬遺傳基因保存提供支撐。