南瓜白粉病病原菌及種質資源抗性鑒定

屈淑平，綦 聰，王云莉，姜 宇，徐文龍，崔崇士

（東北農業大學園藝園林學院，哈爾濱 150030）

南瓜是人類最早栽培蔬菜之一，屬于葫蘆科（Cucurbitaceae）南瓜屬（Cucurbita），為一年生蔓生草本植物，其營養豐富，藥用和食用價值較高。南瓜種植面積逐年增大，但多種病害嚴重影響南瓜植株生長，其中白粉病是主要病害之一。隨著白粉病病情加重，植株無法正常通過光合作用提供營養，導致籽粒不飽滿、果實減產、品質下降等[1]。

目前，引起瓜類白粉病病原菌主要有3個屬：白粉菌屬（Erysiphe）、內絲白粉菌屬（Leveillula）及單囊殼屬（Podosphaera），6個種分別是E.cichoracearum、 E.polygoni、 E.polyphage、 E.communis、L.taurica和P.xanthii。P.xanthii報道最多，其次為E.cichoracearum[2]。P.xanthii已發現有11個生理小種，分別是生理小種0、1、2U.S、2France、3、4、5、N1、N2、N3和N4。

張怡、肖仲久等利用形態觀察及ITSrDNA序列分析方法，分別鑒定河南、貴州省4個城市白粉菌，瓜類白粉病病原菌均為Podosphaera xanthii[曾 用 名 Sphaerotheca fuliginea（Schlecht.Ex Fr.）Pollacci][3-4]。李蘋芳、蘇瑞等利用當地白粉病菌鑒定13個甜瓜通用鑒定寄主，確定江浙滬、新疆地區生理小種分別為race1、race5[5-6]。劉東順等利用同樣方法鑒定確定甘肅地區白粉病生理小種為2Frace和N2[7]。黑龍江地區近年南瓜生產中白粉病病害嚴重，劉秀波等研究黑龍江地區侵染瓜類白粉菌種類及生理小種，確定其病原菌均為Podosphaera xanthii，而2009年優勢生理小種由race1變為2Frace[8-9]。

為進一步調查黑龍江地區侵染南瓜白粉病病原菌種類及生理小種變化，本試驗觀察黑龍江省白粉病病原菌形態結構、分析白粉病病原菌ITS序列，開展13個白粉病甜瓜通用鑒別寄主侵染試驗，以確定病原菌種類及其生理小種，隨后利用鑒定生理小種白粉菌侵染64份南瓜種質資源，通過植株抗白粉病表現篩選高抗白粉病種質資源，為南瓜白粉病抗病基因定位及培育抗白粉病新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

白粉病寄主選用易感病南瓜自交系“JIN-234”及64份種質資源鑒定材料，均由東北農業大學園藝園林學院南瓜育種研究室提供。南瓜自交系“JIN-234”2017年春季種植于哈爾濱市香坊區向陽鎮東北農業大學南瓜實驗基地大棚，用于病原菌分離與鑒定，64份種質資源鑒定材料2018年春季隔離種植于向陽鎮南瓜實驗基地大棚，用于抗性鑒定。

國際通用鑒別寄主：Iran H、Top mark、Vedrantais、PMR45、PMR5、MR29、Edisto47、PI414723、MR1、PI 124111、PI124112、PMR6、Nantais 和Oblong，由上海交通大學黃瓜育種實驗室惠贈。甜瓜鑒別寄主于2018年春季種植于向陽鎮南瓜實驗基地大棚。

1.1.2 白粉病病原菌材料

白粉病病原菌取自東北農業大學南瓜實驗基地自然發病南瓜植株葉片。

1.2 方法

1.2.1 白粉病病原菌分離純化

2017年7月中旬收集自然發病南瓜葉片白粉菌單菌落于吐溫20中，制成2.5×105～5.0×105個·mL-1孢子懸浮液，噴施于南瓜健康幼苗植株葉片上，后置于25～30℃、濕度80%以上環境中，經5次分離純化后利用易感病南瓜植株擴繁，活體保存，用于后續試驗。

1.2.2 白粉病病原菌形態觀察

參照王佩玲等方法[10]，利用挑取法制作臨時玻片觀察分生孢子，水合氯醛組織透明法制作臨時玻片觀察分生孢子梗。參照馬鴻艷等方法[9]，利用KOH溶液觀察纖維狀體，取白粉菌無性世代于載玻片上，滴加1滴3%KOH溶液，蓋上蓋玻片，10×40倍光學顯微鏡下觀察。

1.2.3 致病性檢測

按照科赫法則利用噴霧法作白粉菌回接試驗，檢驗白粉病病原菌致病性。取分離純化后南瓜葉片白粉菌單菌落于吐溫20中，制成2.5×105～5.0×105個·mL-1孢子懸浮液。種植20株南瓜幼苗。當植株長至兩片真葉時，取10株幼苗噴施孢子懸浮液于南瓜葉片上，10株幼苗噴施無菌水滴加吐溫20溶液作對照。將處理后植株幼苗置于25～30℃、濕度80%以上環境中，觀察病原菌發病情況，確定其致病性。

1.2.4 白粉病病原菌分子鑒定

美洲南瓜白粉病病原菌總DNA提取：采用改良CTAB法提取白粉菌總DNA[11]。

ITS序列PCR擴增引物與程序：利用真菌核糖體ITS區段通用引物ITS1、ITS4作PCR，序列為：ITS1（5'TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3'）和 ITS4（5'TCCTCCGCTTATTGATATGC 3'）。 PCR 體系 為：10×Buffer 2μL，dNTP 2μL，DNA模板1.2μL，上下引物各0.8μL，Taq酶0.2μL，ddH2O 13μL。PCR反應條件為：預變性94℃5 min；變性94℃30 s，退火50℃ 30 s，延伸72℃ 45 s，35個循環；再延伸72℃，10 min。

凝膠電泳檢測：取3μL PCR產物，EB染色，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過瓊脂糖凝膠成像系統觀察成像結果。

PCR產物回收與載體連接：參照膠回收試劑盒（購自北京全式金生物技術有限公司）說明操作，利用膠回收產物與T3載體連接，轉化大腸桿菌感受態細胞，通過藍白斑篩選方法挑取陽性單克隆，菌液PCR檢測陽性菌落，送至北京華大基因科技有限公司正反雙向測序。

序列分析：將南瓜白粉病病原菌ITS序列利用BLAST在NCBI核酸數據庫中搜尋比對，使用DNAMAN將軟件作序列比對分析。Mega 5.0鄰接法（NJ）構建系統發育樹。

1.2.5 白粉病病原菌生理小種鑒定

采用國際通用13個甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主。通過寄主分析不同白粉菌生理小種抗感反應以區別本試驗中感染南瓜白粉病病原菌生理小種，寄主對不同生理小種抗感反應表現見表1，每一品系鑒別寄主種植10株。植株長至4葉1心時取分離純化后南瓜葉片白粉菌于吐溫20中，制成濃度為2.5×105～5.0×105個·mL-1懸浮液，噴霧法噴濕鑒別寄主葉片，溫度25～30℃，濕度80%以上，接菌10 d后觀察鑒別寄主發病情況。鑒定標準、病情指數（DI）計算參照文獻[12]（見表1、2）。

病情指數（DI）計算如下:

DI=Σ（sini）·（5N）-1·100

式中，si為發病等級，ni為相應發病等級植株數目，N為調查總株數觀測量。0＜DI≤40時為抗病，記為R；40＜DI＜60時為中間型，記為H；DI≥60為感病，記為S。根據甜瓜鑒別寄主抗、感反應鑒定白粉病菌生理小種。

1.2.6 病原菌鑒定在種質資源開發中的應用

利用分離純化后白粉菌對64份美洲南瓜種質資源在成株期作抗性鑒定，條件與生理小種鑒定接菌試驗一致，接菌20 d后鑒定64份種質資源抗感病情況。鑒定標準參照李錫香[12]等研究（見表2）。病情指數（DI）計算同1.2.5，根據病情指數計算結果判斷種質資源抗性表現。

表1 甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主及其抗感反應Table1 Identification of host racesof melon powdery mildew and its anti-influence

表2 植株抗感白粉病情況鑒定標準Table 2 Identification criteria for resistance to powdery mildew in plants

2 結果與分析

2.1 病原菌形態特征

取分離純化后白粉菌在10×40倍顯微鏡下觀察分生孢子、纖維狀體和分生孢子梗形態（見圖1）。分生孢子呈廣橢圓形，長（28.61±3.51）μm，寬（19.14±2.15）μm。病原菌分生孢子內均含明顯纖維狀體，每個分生孢子內含纖維狀體1～10個，平均5個（見圖1a）。分生孢子梗由孢子串生形成，長（98.54±13.65）μm，寬（13.94±1.78）μm（見圖1b）。通過以上形態特征觀察初步判斷，此白粉菌為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

2.2 病原菌致病性

將純化后白粉病病原菌懸浮液噴霧接種“JIN-234”南瓜幼苗葉片，6 d后葉片表面出現圓形白色粉狀斑點，10 d后植株葉片白粉斑點逐漸聚集成片（見圖2），發病狀態與自然發病情況相似。再次鏡檢發病植株白粉菌，其分生孢子等形態特征與自然發病植株表現一致，表明其仍為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

圖1 病原菌形態觀察Fig.1 Morphological observation of pathogens

圖2 南瓜幼苗接菌10 d后植株感病情況Fig.2 Situation of susceptible plants after 10 d of pumpkin seedlings inoculation

2.3 病原菌分子鑒定

利用改良CTAB法提取南瓜白粉菌總DNA，利用通用引物ITS1、ITS4擴增得到長度約564 bp DNA片段，電泳結果見圖3。

圖3 白粉菌DNA擴增結果Fig.3 DNA amplification results of powdery mildew

該序列GenBank授權登錄號為MH084745。NCBI上BLAST分析發現，南瓜白粉病病原菌ITS核苷酸編碼序列中1～29位為18SrDNA部分序列，30～207位為ITS1區段序列，208～361位為5.8SrDNA全序列，362～505位為ITS2區段序列，506～564位為28SrDNA部分序列。運用DNAMAN將序列與侵染瓜類白粉菌其他序列比對，結果見圖4。結果表明南瓜白粉菌與Podosphaera xanthii序列一致性高達99%，同源性較高。系統發育樹結果可見圖5，南瓜白粉菌ITS序列相比于E.cichoracearum、E.polygoni、L.taurica序列，其與苦瓜單囊殼（Podosphaera xanthii PM2）、甜瓜單囊殼（Podosphaera xanthii PMJS1）、美女櫻單囊殼（Podosphaera xanthii MUMH808）、棉葉膏桐單囊殼（Podosphaera xanthii JG1）、紅雀珊瑚單囊殼（Podosphaera xanthii ET1）等同緣關系最近。通過分子鑒定進一步證明侵染南瓜白粉病病原菌為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

圖4 同源序列比對（紅線區域為保守區域）Fig.4 Comparison of homologoussequences（The red line area is a conservativearea）

圖5 根據ITS序列構建南瓜白粉菌系統進化樹Fig.5 Phytophaga phylogenetic tree constructed based on the ITSsequence

2.4 病原菌生理小種

采用孢子懸浮液噴霧法，將純化的南瓜白粉病菌接種于13個國際通用鑒別寄主葉片上，通過寄主對不同白粉菌生理小種產生的抗感反應區分本試驗中感染南瓜的白粉病病原菌生理小種，鑒定結果見表3。

觀察發現不同寄主抗感反應差異明顯，其中鑒別寄主Iran H、Top mark、Vedrantais、Nantais Oblong接種白粉菌10 d發病，出現肉眼可見近圓形粉狀斑點；20 d充分發病，整株植物葉片及莖干布滿白粉，感病嚴重。而寄主PMR45、PMR5、WMR29、Edisto47、PI414723、MR1、PI 124111、PI124112、PMR6葉片并未出現白粉菌侵染癥狀，表現較強抗病特征。對比表1抗感反應，確認南瓜基地白粉病病原菌生理小種為單囊殼白粉菌中的2France。

表3 鑒別寄主對南瓜白粉病菌抗感反應Table3 Identification of hosts''resistanceto powdery mildew of pumpkin

2.5 病原菌鑒定在種質資源開發中的應用

利用分離純化的白粉菌2France生理小種對64份成株美洲南瓜種質資源作接菌試驗，接菌后20 d鑒定植株抗病等級，結果見表4。不同品系抗病情況不同。高感品系如圖6a和6b所示，基部老葉整片葉覆滿白粉，枯黃變脆，頂端嫩葉也散布白粉菌斑，主蔓和部分葉柄均有白粉菌斑附著；高抗品系植株無明顯菌斑（見6c和6d），葉片依然呈綠色。根據種質資源抗病情況，0＜DI≤20時為高度抗病品系；80≤DI為高度感病品系。64份種質資源中篩選出15份高感病品系和13份高抗病品系（見表4）。

圖6 種質資源中高抗和高感品系Fig.6 Resistance and sensitive plants in Cucurbita pepo strains

表4 64份不同品系美洲南瓜接菌后抗病性鑒定Table 4 Reactions of resistance of 64 strains of Cucurbita pepo after infection

3 討論與結論

單囊殼白粉菌屬于白粉菌目（Erysiphales）白粉菌科（Erysiphaceae）單囊殼屬（Podosphaera），寄主范圍廣泛分布于黃瓜、南瓜、甜瓜、西瓜等作物上。感染葫蘆科白粉病病原菌在無性形態上不易區分，通過分生孢子是否具有纖維體方法區分P.xanthii（有纖維體）和E.cucurbitacearum（無纖維體），Ballantyne證實該區分方法準確可行[13]。臧全宇通過有無纖維狀體鑒定杭州甜瓜白粉病屬于Podosphaera xanthii[14]。本研究觀察南瓜白粉病形態，分生孢子呈廣橢圓形，內含纖維狀體，判斷其屬于單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

rDNA序列克隆和分析手段廣泛應用于病原菌分類。rDNA序列包括轉錄區和非轉錄區，轉錄區包括18S、5.8S、28SrDNA序列，而其中ITS序列進化速度快，具有保守性，在不同科屬種水平上具有特異性，因此通過設計引物比對分析病原菌ITS序列可有效鑒定病原菌分類。張怡等通過分析小麥白粉菌ITS序列，認為小麥白粉菌進化可能與其小種進化有關[11]。馬原松等分析河南白粉菌ITS序列，為病原菌系統分類鑒定及發育等研究提供依據[15]。本試驗通過ITS序列比對及進化樹分析發現，南瓜白粉病菌與Podosphaera xanthii MUMH808，Podosphaera xanthii PM2， Podosphaera xanthii JG1，Podosphaera xanthii ET1，及Podosphaera xanthii PMJS1的ITS序列高度同源。同時通過系統進化樹分析，本試驗中白粉菌與Podosphaera xanthii聚類在同一分支，進一步確定南瓜白粉菌屬于單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）。

白粉病菌生理小種種類多樣，分化快。同種植物不同時間致病生理小種不同。馬鴻艷等2008年調查東北農業大學園藝設施基地致病甜瓜白粉菌生理小種為單囊殼白粉菌2France，而2009～2010年2France未出現，其致病生理小種為單囊殼白粉菌race1和raceN1[9]。Mohamed等發現蘇丹夏季白粉菌優勢小種為單囊殼白粉菌race1，冬季優勢生理小種則為單囊殼白粉菌race2[16]。國內不同地區同一作物感染生理小種不同。北疆地區甜瓜、籽用西瓜白粉菌生理小種及淮北市甜瓜白粉菌生理小種均為單囊殼白粉菌race1[17]。海南省三亞地區西甜瓜優勢小種為單囊殼白粉菌2France。南疆地區甜瓜、籽用西瓜白粉菌生理小種則為單囊殼白粉菌race5[6]。不同設施栽培條件下，感染同種作物的生理小種不同。甘肅皋蘭縣什川鎮露地甜瓜致病菌為單囊殼白粉菌race1，而溫室甜瓜致病菌為單囊殼白粉菌2France。靖遠縣東灣鎮露地甜瓜致病菌為單囊殼白粉菌race1，而大棚甜瓜致病菌為單囊殼白粉菌2France和race7[7]。白粉病菌生理小種進化快，發病時期和發病地域不易確定，需及時、長期鑒定生理小種，觀察其演替情況。因此本研究將連續多年監測向陽鎮南瓜基地，密切關注生理小種種類及分布變化。

近年來不同葫蘆科作物中抗白粉病種質資源研究均有報道。馬鴻艷等鑒定109份甜瓜種質抗白粉病情況，得到19份抗病材料，20份感病材料[18]。左洪波等鑒定51份黃瓜種質資源材料白粉病抗性，得到3份高抗材料，未發現高感病材料[19]。劉鳴韜等鑒定38份南瓜種質白粉病抗性，得到3份高抗材料，21份感病材料[20]。本研究利用鑒定出的白粉病病原菌接種64份南瓜種質資源，得到高抗材料13份及高感材料15份。該研究為挖掘南瓜抗性種質資源材料，抗病基因克隆及培育抗白粉病南瓜新品種等奠定基礎。