土鱉蟲抗兔高膽固醇血癥模型內參基因的評估及應用

張 震，姜恩澤，寧方勇，杜智恒，白秀娟

（東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030）

實時熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）高效、靈敏、特異性強，廣泛應用于分子診斷、生命科學、農業和醫藥領域[1]。樣品獲得和處理、RNA質量和完整性、反轉錄、PCR效率等影響qPCR結果[2]。因此，qPCR分析數據需標準化處理以提高結果準確性[3]。一般以穩定表達內參基因作為內源性對照[4]。理想內參基因，在組織類型和試驗中必須穩定表達。研究表明，內參基因（Gapdh和Actb等）在不同物種、組織類型、細胞系、發育階段和試驗中非恒定表達，不存在理想通用內參基因[5-6]。因此，依據不同條件選擇合適內參基因，對qPCR分析結果準確性十分重要。

高膽固醇血癥（Hypercholesterolaemia）屬于血脂異常癥，表現為血清總膽固醇水平（TC）偏高，引起動脈粥樣硬化、誘發心肌梗死、中風和腦卒中等疾病，應高度重視高膽固醇血癥預防和治療[7]。目前，高膽固醇血癥治療藥物主要為他汀類、貝特類等西藥，作用單一，易引起不良反應，副作用較強。中藥治療優點為藥源豐富、不良反應小、多靶點等，降膽固醇類中藥研究日益增多。土鱉蟲（Eupolyphaga steleophaga）是傳統中藥，為鱉蠊科（Corydiidae）昆蟲地鱉（Eupolyphaga sinensis Walker）或冀地鱉（Steleophaga plancyi Boleny）雌蟲干燥體。趙德忠、王征等報道土鱉蟲可調節肥胖大鼠血脂[8-9]；趙志壯等應用qPCR技術進一步探討土鱉蟲凍干粉治療高脂血癥家兔作用機制[10]。應用qPCR技術可加快土鱉蟲抗膽固醇藥理作用分子機制研究，但目前尚無該模型相關內參基因評估。本文旨在使用5種不同算法GeNorm,BestKeeper,NormFinder，ΔCt和RefFinder評估9個常用內參基 因（Actb、B2m、Eef1a1、Gapdh、Hprt1、Ppia、Rpl5、Sdha、Ywhaz）在土鱉蟲抗兔高膽固醇血癥模型肝臟中表達穩定性，為該模型提供合適內參基因；應用最穩定內參基因標準化Lxrα、Abca1和Cyp7a1基因mRNA表達，從分子水平研究土鱉蟲調節膽固醇機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

60只2月齡雄性哈白兔，體重（2.0±0.25）kg，購自華強皮草開發有限公司。

1.2 主要儀器

7500型實時熒光定量PCR儀，購自美國應用生物系統公司（ABI）；離心機，購自上海安亭科學儀器廠；紫外分光光度計和高速冷凍離心機，購自Eppendorf（中國）有限公司。

1.3 藥物與試劑

土鱉蟲粉購自黑龍江省哈爾濱市中藥材大市場；組織RNA提取試劑盒，購自OMEGA公司；反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒，購自北京全式金生物科技有限公司。

1.4 分組、模型制備和樣品采集

單籠飼養、自由飲水預飼基礎飼料7 d后，60只雄性哈白兔隨機分為2組，空白組15只，飼喂基礎飼料；高膽固醇血癥組45只，飼喂高膽固醇飼料（79%基礎飼料+1%膽固醇+10%豬油+10%蛋黃粉），制備高膽固醇血癥兔，制備期8周。每2周稱重1次，每組隨機抽取5個樣本檢測12 h空腹血清膽固醇以監測造模情況，8周結束時，檢測所有個體重和12 h空腹血清膽固醇。

將高膽固醇血癥兔隨機分為3組，對照組11只，高、低劑量給藥組各12只。高、低劑量給藥組分別飼喂含有0.4和0.2 g·kg-1土鱉蟲粉基礎飼料，空白組和對照組飼喂基礎飼料，治療期6周。于治療期第3周，各組隨機抽取3只檢測12 h空腹血清膽固醇。治療結束時，分別取空白組、對照組和高、低劑量給藥組各10只檢測12 h空腹血清膽固醇，處死后迅速取肝組織分裝于凍存管置于液氮速凍，-80℃冰箱保存。

1.5 RNA提取及反轉錄

按OMEGA組織RNA提取試劑盒說明書提取肝組織總RNA，使用紫外分光光度計檢測RNA純度并計算濃度。按全式金反轉錄試劑盒說明反轉錄，反轉錄體系為：總RNA 1μg，2×TSReaction Mix 10 μL，Anchored Oligo（dT）1 μL，Trans Script RT/RI Enzyme Mix 1μL，gDNA Remover 1μL，補足RNase-Free Water至20μL，混勻。反轉錄條件為：45℃30 min，85℃5 s。所獲cDNA 5倍稀釋后用于qPCR分析。

1.6 實時熒光定量PCR（qPCR）分析

引物序列見表1。反應體系10μL，包括：cDNA模板1 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.2 μL，2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 5μL， Passive Reference DyeⅡ（50×）0.2μL，補足ddH2O至10μL。反應條件為：50℃ 2 min；95℃ 30 s；（95℃ 5 s，60℃ 30 s）×40個循環；95℃ 15 s；60℃1 min;95℃30 s。每個樣品3次重復，Ct取平均值。

表1 引物序列和特點Table1 Primer sequences and character

1.7 數據處理與分析

采用SPSS24.0中ANOVA模型LSD法分析不同組間血清總膽固醇水平（TC）和膽固醇相關基因表達差異。使用GeNorm、BestKeeper、NormFinder、ΔCt和RefFinder算法評估內參基因穩定性。采用2-ΔΔCt法分析肝Lxrα、Abca1和Cyp7a1 基因相對表達比率。

GeNorm依據Ct值計算每個內參基因（基因個數≥3）組內配對變異值，該值為基因穩定量度值（M值，M值＜0.5內參基因較穩定），M值為內參基因穩定值，M值越小內參基因越穩定。GeNorm配對分析標準化因子n（NFn）和標準化因子n+1（NFn+1），分析結果定義為Vn/n+1，當Vn/n+1＜0.150時，最佳內參基因數量為n，即無須使用n+1個內參基因保證數據可靠性。）和NFn+1）分別代表n和n+1個M值幾何平均數，其中n為M值序列號[11]。BestKeeper依據Ct值描述性統計分析內參基因（基因個數≤10），分析結果中標準偏差值（SD值＜1內參基因較穩定）為內參基因穩定值，SD值越小內參基因越穩定[12]。NormFinder依據Ct值計算每個內參基因（基因個數≥8）組內變異和組間變異，并將組內變異和組間變異值合并，定義為內參基因穩定值，對應內參基因穩定性，穩定值越小內參基因越穩定[13]。ΔCt算法依據Ct值計算配對內參基因（基因個數≥3）組內平均標準偏差值（SD平均值），SD平均值為內參基因穩定值，值越小內參基因越穩定[14]。RefFinder依據以上4種算法計算每個內參基因幾何平均數加權值（GM值），GM值為內參基因穩定值，值越小內參基因越穩定[15]。

2 結果與分析

2.1 各階段血清總膽固醇（TC）水平

共制備高膽固醇血癥兔35只，空白組（n=15）與高膽固醇血癥型組（n=35）差異極顯著（P＜0.01），表明制備成功。治療結束時，空白組（n=10），高（n=10）、低（n=10）劑量給藥組與對照組（n=10）差異極顯著（P＜0.01），各給藥組與空白組差異不顯著（P>0.05），各給藥組間差異不顯著，表明2種土鱉蟲劑量均可降低血膽固醇（見表2）。

表2 土鱉蟲對高膽固醇血癥兔血清總膽固醇的影響Table2 Effectsof eupolyphaga on total cholesterol of rabbitswith hypercholesterolaemia (mmol·L-1)

2.2 肝臟中內參基因穩定性

肝臟中5種算法評估9個內參基因穩定性見表3，確定各種算法中4個最穩定內參基因。GeNorm評估4個最穩定內參基因為：B2m=Ywhaz>Ppia>Eef1a1，BestKeeper評估4個最穩定內參基因為：B2m>Ywhaz>Ppia>Eef1a1，NormFinder評估 4個最穩定內參基因為：Gapdh>Sdha>Eef1a1>Ppia，ΔCt評估4個最穩定內參基因為：Gapdh>Eef1a1>Sdha>Ppia，RefFinder評估4個最穩定內參基因為：Gapdh>B2m>Ywhaz>Eef1a1。結果表明，每種算法評估最穩定內參基因不同，BestKeeper和GeNorm評估結果中3個基因（B2m,Ywhaz,和Eef1a1）與RefFinder相同，ΔCt和NormFinder結果中2個基因（Gapdh和 Eef1a1）與RefFinder相同。5種算法中Hprt1、Actb和Rpl5均為不穩定內參基因，表明其在模型中表達不穩定，不適合標準化該模型qPCR數據。

綜上分析，5種算法結果差異較小，整體趨勢接近一致。綜合各算法結果，4個較穩定內參基因為：Gapdh、B2m、Ywhaz和Eef1a1，3個最不穩定內參基因為：Hprt1、Actb和Rpl5。

表3 肝臟中五種算法評估結果Table 3 Evaluation results of reference genes by fivedifferent algorithmsin theliver

2.3 肝臟中最穩定內參基因

GeNorm計算配對變異Vn/n+1值并比較給定閾值0.150，確定最佳內參基因數量。肝臟中配對變異Vn/n+1值見圖1。結果顯示，肝臟中所有Vn/n+1值均小于0.150，表明n取最小值即滿足算法，因此肝臟中最佳內參基因數量為2。

綜合內參基因穩定性排序和最佳內參基因數量，肝臟中最穩定內參基因為Gapdh和B2m。

2.4 土鱉蟲對肝Lxrα、Abca1和Cyp7a1基因mRNA表達的影響

使用Gapdh和B2m標準化肝Lxrα、Abca1和Cyp7a1基因mRNA表達結果見表4。

圖1 GeNorm確定4種組織中最佳內參基因數Fig.1 Determination of the optimal number of referencegenesin thefour tissues using the GeNorm algorithm

表4 肝Lxrα、Abca1和Cyp7a1基因mRNA表達水平Table 4 Expression level of Lxrα、Abca1 and Cyp7a1 in liver

肝LxrαmRNA表達水平，對照組與其他組差異顯著（P＜0.05），各給藥組與空白組差異不顯著（P>0.05），給藥組間差異不顯著（P>0.05）。結果表明，土鱉蟲可上調高膽固醇血癥兔肝LxrαmRNA表達，上調效果高劑量略高于低劑量。

肝Abca1 mRNA表達水平，對照組與其他組差異顯著（P＜0.05），各給藥組與空白組差異顯著（P＜0.05），給藥組間差異不顯著（P>0.05）。結果表明，土鱉蟲可上調高膽固醇血癥兔Abca1 mRNA表達，上調效果高低劑量接近一致。

肝Cyp7a1 mRNA表達水平，對照組與其他組差異顯著（P＜0.05），高劑量給藥組與空白組差異不顯著（P>0.05），低劑量給藥組與空白組差異顯著（P＜0.05），給藥組間差異不顯著（P>0.05）。結果表明，土鱉蟲可上調高膽固醇血癥兔肝Cyp7a1 mRNA表達，上調效果高劑量略高于低劑量。

3 討 論

正常兔血漿膽固醇水平較低，對飼料中膽固醇敏感，飼喂含0.3%～2%膽固醇和4%～8%脂肪飼料4周后，血漿膽固醇水平快速提升[16]。因此，兔成為降脂藥物研究重要試驗動物[17-18]。本研究中，哈白兔血清膽固醇水平快速提升，可用于制備高膽固醇血癥兔模型，但制備成功率未達100%，可能為環境、年齡、品系等因素造成[19]。王玉明等研究發現，土鱉蟲可降低高脂血癥小鼠血清膽固醇濃度[20]；張晶等在Ⅱ型糖尿病大鼠研究中也得到類似結果[21]。本研究結果顯示，給藥組與對照組差異極顯著（P＜0.01），表明高、低劑量土鱉蟲粉均可降低高膽固醇血癥兔血清膽固醇，與白秀娟等研究結果相似[22]。

qPCR是檢測基因表達重要技術，選擇穩定內參基因可保證qPCR結果準確，組織類型和試驗條件影響內參基因穩定性。Nachar等研究表明，不同內參基因在兔左心室舒張功能紊亂模型中穩定性不同[23]；陳瑞等研究表明，兔不同發育階段和組織最穩定內參基因不同[24]。本研究結果表明，不同內參基因在模型肝臟中穩定性不同，Gapdh、B2m、Ywhaz和Eef1a1較Hprt1、Actb和Rpl5更穩定。不同算法評估內參基因穩定性存在差異。Almeida-Oliveira等研究表明，在高膽固醇血癥小鼠脂肪組織中，GeNorm、BestKeeper、NormFinder、ΔCt和RefFinder算法評估內參基因穩定性結果不同[25]。5種算法結果差異原因為算法原理不同，GeNorm和ΔCt為組內變異比較；BestKeeper為簡單統計描述；NormFinder為組內組間變異比較；RefFinder為幾何平均數加權計算，不具有生物學意義。本研究中，盡管5種算法評估內參基因結果不同，但差異較小，表明各算法評估結果均具有一定準確性，綜合5種算法結果更準確，與Almeida-Oliveira等評估結果一致[26]。為提高試驗效率，計算最佳內參基因數量十分重要。Vandesompele等研究表明，最佳內參基因數量不可小于2個[11]。GeNorm可確定試驗所需最佳內參基因數且數量不小于2個，董曉麗等使用GeNorm確定免疫刺激后小鼠肝臟最佳內參基因數量為2個[26]。本研究中，適用模型肝臟最佳內參基因數量為2個，符合最佳內參基因數量要求。綜合5種算法，土鱉蟲抗哈白兔高膽固醇血癥模型肝臟最穩定2個內參基因為Gapdh和B2m，可保證qPCR數據準確性又兼顧時間、成本等因素，符合其試驗研究發表最少信息指南（MIQE指南）[2]推薦策略。

探討土鱉蟲調節膽固醇機制，應主要研究影響膽固醇代謝的關鍵基因。冷雪冰等研究表明，土鱉蟲可上調高血脂家兔Apo E和LDL-R基因表達量[27]；李洪萍等研究表明土鱉蟲凍干粉可下調高血脂肉兔肝臟SR-BI基因表達[28]。目前，尚無其他相關基因表達研究。ATP結合盒轉運體A1（Abca1）為膜轉運體ABC家族成員，高表達于肝腎等組織，主要功能為調控胞內膽固醇轉運至胞外和高密度脂蛋白（HDL）產生，加快胞內膽固醇外排而降低胞內膽固醇濃度[29]。細胞色素7A1（Cyp7a1）酶是一種微粒酶，僅在肝臟中表達，為催化膽汁酸經典合成途徑限速酶，Cyp7a1基因表達提高后，增強膽固醇向膽汁酸轉化，降低體內膽固醇累積[30]。肝X受體α（Lxrα）為核受體家族Lxrs亞型之一，高表達于肝臟等組織，可調控Abca1和Cyp7a1基因表達，為調節肝臟膽固醇代謝重要基因[31]。本研究結果表明，治療結束時，與模型組比較，各給藥組均可顯著上調Lxrα、Abca1和Cyp7a1基因mRNA表達（P＜0.05），與白秀娟等[32]發現土鱉蟲可上調高血脂癥家兔HDL類似，表明提高膽固醇外排和轉化相關基因表達可能為土鱉蟲治療高膽固醇血癥分子機制。土鱉蟲成分復雜，其調節膽固醇分子機制尚待深入。

4 結論

哈白兔可制備土鱉蟲抗兔高膽固醇血癥模型；5種算法綜合評估該模型肝臟最穩定2個參基因為Gapdh和B2m，為應用qPCR技術深入研究該模型機制奠定基礎；土鱉蟲調控膽固醇機制可能與上調Lxrα、Abca1和Cyp7a1基因mRNA表達有關。