豬流行性腹瀉病毒的研究進展—流行病學病原學及防控

孫萌萌,王曉佳

(中國農業大學動物醫學院,北京 海淀100193)

冠狀病毒是感染多種家畜、家禽、寵物以及人類的重要病原微生物,第九次國際病毒分類委員會將冠狀病毒科分為α、β 和γ 三個屬。其中豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)與傳染性胃腸炎病毒(TGEV)屬于α-冠狀病毒,其在全世界流行并導致仔豬腹瀉[1]。豬呼吸道冠狀病毒(PRCV)是TGEV 的3 個基因缺失的突變株,相當于TGEV 的天然弱毒疫苗,因此其流行使TGEV的發生趨于下降[2]。嚴重急性呼吸綜合征病毒(SARS-CoV)屬于β-冠狀病毒,是導致2003 年“非典”罪魁禍首。傳染性支氣管炎病毒(IBV)是γ-冠狀病毒的代表,對養禽業危害重大。2011 年病毒分類委員會新增了一個δ 屬,豬德爾塔冠狀病毒(PDCoV)成為δ-冠狀病毒的研究模型,這也是引起仔豬腹瀉的一種重要病原體。2017 年9 月份,中山大學發現了一種對新生仔豬具有高致死性的新型冠狀病毒,命名為豬腸道-冠狀病毒(PEAV),與源于蝙蝠的腸道冠狀病毒(HKU2)核苷酸同源性為95%[3]。同年9 月份,浙江大學聯合溫氏食品集團確證了一種新的豬腸道冠狀病毒(SeACoV),與HKU2 核苷酸同源性為95%,SeACoV 不與PEDV、TGEV,以及PDCoV 產生抗體交叉反應[4],這對我國新生仔豬腹瀉的防控提出新的挑戰。豬腸道冠狀病毒的高變異特性目前已經成為仔豬腹瀉防控的難點,且日趨復雜,對養豬業的健康發展構成嚴重威脅。

流行病學調查表明,PEDV 目前仍是引起仔豬腹瀉的最主要病原體,感染仔豬死亡率可達80%以上。本文綜述了該傳染病近幾年來的流行狀況、病毒功能蛋白的致病機理,以及新型防控技術。

1 PEDV 流行病學

20 世紀70 年代歐洲(英國和比利時)最早發生了豬流行性腹瀉病(PED),隨之在世界范圍內廣泛流行,1978 年PEDV 首次被鑒定出來[5]。隨著各種防控技術的發展,之后的幾十年PED 逐漸減少,呈零星暴發。然而2010 年以來,該病卷土重來,不僅冬季多發,夏季發病也成為“新常態”,加之該病毒一直在變異,經典疫苗保護率低,同時返飼的做法帶來很大的疾病風險,給養殖業造成了重大損失并帶來更多潛在威脅與挑戰。

1.1 國外流行病學調查 2013 年4 月美國發現PEDV 變異毒株,隨后蔓延全國,截至2014 年6 月,已有30 個州的實驗室在7 250 個豬群中檢測到陽性病例;調查顯示,PEDV 出現后的一年已經造成了美國400~500 萬頭仔豬的死亡[6]。2014 年6 月美國農業部發布了聯邦政府令,要求報告所有PEDV感染病例,以隨時查閱美國該傳染病的流行情況。在德國北部,2014 年出現了PED 的急性暴發,同年夏天在烏克蘭也暴發了PED,仔豬死亡率接近100%[7]。在亞洲的日本,2013 年10 月九州第一次發現PEDV 感染,2 個月后農場發病率達19.5%;2013 年末開始,韓國的PED 疫情顯著增加,并迅速席卷全國[8]。通過病毒基因相似性的推斷,PEDV在全球可能存在循環傳播[9]。

1.2 國內流行病學調查 2010 年以后,PEDV 毒株發生了強毒變異,我國暴發了嚴重的PEDV 與TGEV的混合感染,7 日齡內仔豬致死率高達60% ~100%[10]。GenBank 中收錄的數據顯示,目前9 個省直轄市均有PEDV 流行,陽性率為61.10% ~78.49%,西南、西北、華北最為嚴重。其中,2011-2013 年間,廣西34 個縣144 個豬場216 份病料的陽性率為27.78%[11],福建128 份病料的陽性率為67.97%[12],安徽37 個規模化豬場186 份病料的陽性率為59.1%[13],廣東102 個養殖場236 份病料的陽性率為33.05%[14],北京地區1 201 份病料的陽性率為4.66%[15]。2014-2016 年間,東北地區88 個豬場264 份病料的陽性率為74.62%[16],山東3 035 份病料的陽性率為67.49%,第四季度高達88.57%[17]。

2 PEDV 病毒蛋白及其功能

PEDV 基因組的編碼順序為5′-NSP1-15-SORF3-E-M-N-3′,病毒基因組編碼結構蛋白—纖突糖蛋白(S)、核衣殼蛋白(N)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E),15 個非結構蛋白(Nonstructural protein,NSP),以及輔助蛋白ORF3。

2.1 結構蛋白 S 蛋白是PEDV 纖突的主要成分,可以識別宿主細胞上的受體,促進病毒與細胞膜發生融合,氨基酶APN 曾被認為是PEDV 的作用受體,但未被進一步確定。我國科學家近期發現,Occludin 蛋白有利于病毒入侵細胞,可能是協助受體[18]。目前該病毒受體尚不清楚。S 蛋白擁有良好的免疫原性和反應原性,因此是設計基因工程疫苗的主要靶位,在免疫學診斷技術中的應用也比較廣泛。PEDV 的變異主要發生在S 蛋白上,因此可用來探究PEDV 各毒株之間的遺傳關系、流行病學以及基因突變[19]。N 蛋白是一種磷酸化的核衣殼蛋白,病毒感染早期豬體內就能檢測出N 蛋白抗體,因此被作為診斷靶標之一;N 蛋白的抗原表位還可以誘導機體產生有效的免疫應答。2013 年科學家發現,缺失核仁定位信號的N 蛋白不再定位于宿主細胞核,喪失了使宿主細胞在G2/M 期停滯的能力,并影響病毒RNA 的合成,這為闡明病毒蛋白與細胞互作關系提供了新思路[20];PEDV 的N 蛋白還可誘導內質網應激并激活NF-κB,并上調表達IL-8等炎癥因子[21]。最近發現N 蛋白還可以與核仁磷酸蛋白npm1 相互作用,保護病毒免受蛋白酶的水解,因而利于病毒自身復制[22]。M 蛋白對于病毒粒子裝配成熟過程很重要,被作為基因工程疫苗的候選蛋白,M 蛋白還可介導α-干擾素的產生,但前提是必須有補體的存在[23]。E 蛋白在病毒的組裝和出芽過程中發揮著重要的作用,近年來發現,PEDV 的E 蛋白主要定位于內質網,TM 結構域的V4 區域對調節病毒誘導的應激與免疫反應至關重要,但是不影響細胞周期,E 蛋白可能在炎癥反應與持續感染中發揮著重要的作用[24-25]。

2.2 非結構蛋白 冠狀病毒非結構蛋白參與調節病毒基因組的復制以及感染過程,是重要的功能蛋白。2013 年茅翔與邊葶藶將冠狀病毒非結構蛋白NSPs 的相關研究進行了較全面的闡述[26-27],本文綜述了近幾年來,PEDV 幾種NSPs 結構與功能的研究進展。NSP1 是復制酶多聚蛋白N 端的裂解產物,以一種奇特的雙向調節機制來抑制宿主基因的轉錄和表達,可通過結合在宿主核糖體上來阻止宿主蛋白的翻譯。PEDV 的NSP1 的兩個α-螺旋中間有6 個β-折疊結構[28],這與SARS-CoV 相似;NSP1可通過蛋白酶依賴的途徑降解CBP,阻礙干擾素調節因子IRF-3 的活性[29],還可抑制IFN-β 啟動子活性[30],因此利于PEDV 逃避宿主天然免疫反應。NSP3 是一種多功能蛋白,含有鋅結合域,可水解NSP1/NSP2 和NSP2/NSP3,且與病毒感染早期基因組RNA 定位到復合體有關。PEDV 的NSP3 也包括兩個木瓜酶樣蛋白結構域(Papain-like protease,PLP),其中PLP2 可降解干擾素通路蛋白RIG-I 與STING,因此阻礙天然免疫信號的傳遞[31]。NSP5編碼3C 樣蛋白酶(3C-like proteinase,3CLpro),是病毒成熟所必須的蛋白,也是抗病毒抑制劑研究的主要熱點。NSP5 在結晶體狀態下以緊密的二聚體形式存在,被認為是蛋白酶的活化形式,N 末端對其構象影響不明顯,但其缺失卻可導致活性完全喪失。近期研究者們發現,PEDV 3CLpro 在231 位谷氨酸殘基處可切割NEMO,影響干擾素的產生[32]。NSP7 與病毒復制的調節、轉運和病毒粒子的組裝有關,在感染早期定位于病毒復制復合體,而在后期則定位于膜蛋白聚集位點。PEDV 的NSP7 亦可顯著抑制IFN-β 啟動子活性以拮抗Ⅰ型干擾素應答[33]。目前對PEDV 編碼蛋白功能相關研究較少,進一步探索病毒蛋白與細胞蛋白的互作,病毒蛋白對免疫系統的影響,病毒蛋白與復制的關系等,可為疫病防控提供新思路,并為新型疫苗設計奠定基礎。

2.3 ORF3 PEDV 不同毒株的ORF3 存在著各種突變,某些病毒弱毒株甚至缺失ORF3,提示該基因與病毒的毒力有關,可用作區分毒株的標志。近期研究表明,強毒株ORF3 蛋白具有離子通道活性,ORF3 基因突變或缺失可顯著降低病毒滴度[34]。有一些報道表明,輔助蛋白缺失的SARS-CoV 重組病毒,其增殖能力與野生型近似,但是在動物體內感染力明顯減弱,低劑量病毒即可激發T 細胞反應。作為PEDV 唯一的輔助蛋白,將流行株的ORF3 進行突變重組,可為培育高效的候選疫苗毒株提供思路。

3 防控技術

3.1 疫苗 2010 年以前,我國研究人員自行研制了滅活苗,免疫后仔豬的主動保護率達85%以上,被動免疫的仔豬保護率為90%以上[35],弱毒苗保護率為94.6%[36],TGEV-PEDV 二聯弱毒苗的免疫保護率達97.7%[37]。然而,隨著突變毒株的大面積流行,已有的疫苗都不能提供全面保護。當前我國研究者將PEDV 突變毒株進行了生物學鑒定,疫苗臨床前試驗也在緊密開展。2017 年Vaccine 期刊報道了2 篇我國研究人員關于PEDV 疫苗的研究進展。其中一個團隊將Zhejiang08 毒株進行致弱,免疫后誘導仔豬產生了高滴度中和抗體,免疫14 天后的仔豬對流行毒株感染產生了完全保護[38]。另一個研究團隊將滅活苗用生物可降解的納米顆粒進行包被,鼻內接種給晚期妊娠母豬,發現新生仔豬獲得良好的被動免疫,死亡率降低[39]。2013 年美國PED 暴發后,碩騰公司基于新分離的毒株研制出弱毒苗,HARRIS 公司研發了甲病毒RNA 復制子疫苗[40]。韓國與日本也相繼研制出滅活苗83P-5、96P-4、KPEDV-9、SM98P 等,可誘導新生仔豬產生體液免疫來對抗PEDV 的感染[41]。近年來PEDV 基因工程疫苗的研發也獲得了很多關注,如轉基因植物、乳酸菌,以及酵母疫苗。研究者們在煙草中轉入了PEDV 的S 基因或其主要抗原位點,給小鼠飼喂這種轉基因植物可誘導小鼠產生全身免疫和黏膜免疫,對仔豬也有良好的保護作用[42-43]。研究者們還構建了PEDV 的S 基因不同片段及N 基因重組益生菌表達系統,這種靶向黏膜樹突狀細胞的口服疫苗能有效誘發益生菌分泌型免疫球蛋白A 以及體液免疫反應,有效提高疫苗抗原傳遞效率,為誘導有效的免疫應答提供有效策略[44]。此外,利用酵母表達系統作為載體,構建含有S 基因的疫苗,可誘導高水平IgA 且可有效地激發細胞免疫[45]。

3.2 抗病毒制劑 目前尚無商品化抗病毒制劑。較早時采用高免血清與卵黃抗體等方法,即將PEDV 感染產蛋母雞,然后收集卵黃制備高效價的卵黃抗體作為治療劑,治療后仔豬死亡率降為16.7%[46]。有研究者制備了高免血清,治愈率達87.5%[47]。在藥物開發過程中,天然產物是重要的寶庫,近年來研究逐漸增多。據報道,槲皮素-7-鼠李糖苷可高效抑制PEDV 復制,IC50為14 ng/mL[48]。近期發現銀杏果皮提取的多糖可抑制病毒入侵,IC50為1.7 μg/mL[49]。此外,海藻的幾種多酚類提取物,可在μmol/L 濃度抑制病毒入侵與復制[50];從山茶花中提取的幾種齊墩果烷三萜,可在μmol/L 濃度抑制PEDV 蛋白合成[51]。本課題組篩選出一種植物提取生物堿,在500 nmol/L 使用濃度下可完全抑制PEDV 感染細胞,0.05 mg/kg·bw 使用量可使感染仔豬的組織病變與癥狀完全消失[52]。此外,還有一些復方藥物的報道,如對212 頭發病仔豬后海穴注射穿心蓮加黃連素,注射1~2 次即痊愈[53];將參苓白術散灌服患病仔豬,后海穴注射頭孢曲松鈉+鏈霉素+黃芪免疫肽,也取得了顯著的治療效果[54];將金銀花、黃連等中藥提取物治療仔豬腹瀉,治愈率可達94.44%[55]。這些天然產物具有抑制病毒復制、調節免疫反應、抗炎鎮痛等功效,靶向宿主細胞的抑制物亦可最大限度地減少耐藥性可能,而多靶位制劑的聯用有望進一步安全、有效地發揮抗病毒效果。

4 展望

毋容置疑,當前PEDV 感染仍然呈現嚴重態勢,關于PEDV 的研究存在著一些挑戰:(1)該病毒的分子致病機理尚不清楚;(2)遭受PEDV 的豬場可能在地區或全國范圍內成為潛在傳播的病原儲藏庫;(3)病毒變異株的出現速度快,基于經典毒株CV777 研制的疫苗已經不能對豬群提供完全的保護;(4)當前的疫苗抗原遞呈途徑(口腔或者鼻內接種)并不理想。PDEV 的防治仍以疫苗為主,篩選以臨床分離培養的變異毒株作為疫苗候選毒株,馴化出免疫原性好且毒價高的弱毒株,將是PEDV 常規疫苗研發和產業化的重點。此外,目前臨床上將具備抗病毒活性的生物提取物作為添加劑或者聯合制劑使用,成為該疫病緊急防控策略的重要組成部分,這也為疾病的防治提供了新的思路。相信隨著分子生物學、免疫學、基因工程技術的不斷發展,以及PEDV 致病機理和免疫機制研究的深入研究,將逐步推進PEDV 疫苗以及生物治療制劑的研發進程,為該病毒性傳染病的防控乃至凈化作出重要而積極的貢獻。