影響豬流行性腹瀉病毒分離培養(yǎng)的因素

劉太峰,孫明潔,胡桂學(xué)

(1.吉林工程職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院,吉林 四平136001;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 長春130118)

近些年養(yǎng)豬場備受仔豬腹瀉的困擾,而豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是引起腹瀉的最主要病原之一。PEDV 是冠狀病毒科冠狀病毒屬成員,為有囊膜的單股正鏈RNA 病毒,基因組全長約28 000 nt,編碼4 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(S、E、M 和N)和3 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(ORF1a、ORF1b 和ORF3)。其中S 蛋白是PEDV 最重要的結(jié)構(gòu)蛋白,主要負(fù)責(zé)結(jié)合細(xì)胞受體,調(diào)節(jié)病毒感染,在病毒侵入宿主細(xì)胞、組織嗜性和誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生等方面發(fā)揮重要作用[1]。1971 年P(guān)EDV 首次在英國被發(fā)現(xiàn),隨后廣泛流行于世界各地。然而,PEDV 毒株的分離一直是其深入研究的瓶頸問題,直到1988 年Hoffman 首次利用胰酶及Vero 細(xì)胞成功分離到PEDV 毒株[2]。隨后,陸續(xù)有研究利用Vero 細(xì)胞成功分離了CV777、DR13 和83P-5 等細(xì)胞適應(yīng)性毒株。起初這些毒株的傳代并不穩(wěn)定,病變效應(yīng)也不明顯,通過高傳代次才能獲得穩(wěn)定的生長能力。PEDV 毒株是如何適應(yīng)細(xì)胞的分子機(jī)制也不明確,多數(shù)實(shí)驗(yàn)室均面臨著PEDV 毒株傳代培養(yǎng)不穩(wěn)定的問題。因此,當(dāng)前研究焦點(diǎn)多集中在病毒的S 蛋白、胰酶、pAPN 和細(xì)胞系等影響因素,在PEDV 分離培養(yǎng)中的作用。本文從以上幾種因素的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期為PEDV 穩(wěn)定體外培養(yǎng)和細(xì)胞適應(yīng)機(jī)制研究提供參考。

1 S 蛋白及其功能

PEDV S 蛋白是病毒表面的“花冠”即纖突,屬于Ⅰ型膜融合蛋白,由4 152 nt 編碼1 383 個(gè)氨基酸,由N 端的受體結(jié)構(gòu)域S1 和C 端的膜融合區(qū)S2共同組成。其中,S2 區(qū)還可分為3 個(gè)亞區(qū),為跨膜固定區(qū)、胞外區(qū)和胞質(zhì)尾區(qū)。C 基末端主要由疏水氨基酸組成,可對(duì)S 蛋白起到定植作用,與病毒粒子的吸附感染和抗原性密切相關(guān)。2010 年一種不同于CV777 的變異毒株廣泛流行,經(jīng)過基因比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),變異株相比CV777 在S 基因共有198 個(gè)堿基發(fā)生突變,其中存在15 個(gè)堿基的插入和6 個(gè)堿基的缺失并伴有大量點(diǎn)突變,S1 區(qū)突變占73.3%。變異株不僅造成當(dāng)前疫苗免疫的失敗,而且改變了多個(gè)抗原位點(diǎn),產(chǎn)生了多種未知的影響。因此,分離當(dāng)前變異毒株,制備流行株疫苗迫在眉睫。研究顯示,冠狀病毒成功感染靶細(xì)胞需要完成兩步,首先通過依靠宿主細(xì)胞受體與細(xì)胞表面相結(jié)合,然后病毒的囊膜與細(xì)胞膜融合并釋放病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),而這兩步的完成均需要S 蛋白的調(diào)控[3]。對(duì)最初的典型Ⅰ類細(xì)胞膜融合蛋白,禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的HA 蛋白融合特征進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),在HA 蛋白融合過程中最關(guān)鍵的一步即HA需要被水解成HA1 和HA2 兩個(gè)片段,隨后受體結(jié)合亞單位HA1 與靶細(xì)胞表面的唾液酸受體結(jié)合。HA2 通過結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變形成α-螺旋的七肽重復(fù)序列,并逐漸變化形成緊湊的卷曲結(jié)構(gòu),而利于病毒基因組釋放進(jìn)入靶細(xì)胞[4]。PEDV S 蛋白同樣也是位于病毒表面的Ⅰ類跨膜蛋白,其具有流感病毒HA 很多相似的結(jié)構(gòu)和融合機(jī)制。因此對(duì)于PEDV 分離培養(yǎng),可以參考流感病毒HA 的構(gòu)象變化機(jī)制,對(duì)觸發(fā)S 蛋白構(gòu)象的不同因素進(jìn)行分析研究,闡明PEDV S蛋白融合機(jī)制和誘導(dǎo)受體結(jié)合的條件,為PEDV 毒株穩(wěn)定體外增殖及疫苗株開發(fā)創(chuàng)造可能。

2 蛋白酶

2.1 胰蛋白酶 胰酶是一種典型的絲氨酸肽酶,已廣泛應(yīng)用于多種病毒的體外分離研究中,主要負(fù)責(zé)裂解激活糖蛋白。當(dāng)前研究顯示,鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus,MHV)的S 蛋白可被胰酶裂解為S1 區(qū)和S2 區(qū)兩部分,而這個(gè)裂解位點(diǎn)可促進(jìn)病毒與細(xì)胞的融合[5]。Matsuyama 研究發(fā)現(xiàn),多數(shù)冠狀病毒感染過程基本相同,囊膜蛋白需要兩步構(gòu)象改變。首先,病毒的S1 區(qū)與特定的受體蛋白結(jié)合,隨后通過蛋白水解酶或其他條件觸發(fā)S蛋白發(fā)生一系列構(gòu)象改變,最終形成易于細(xì)胞膜融合的六螺旋體結(jié)構(gòu)(6HB)[6]。Shirato 等通過控制胰酶的有無,對(duì)感染的Vero 細(xì)胞進(jìn)行病毒感染試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),胰酶存在的條件下PEDV 感染增強(qiáng)并被有效的釋放到培養(yǎng)液中,而在無胰酶存在的情況下病毒釋放受到較大的阻礙,并對(duì)無胰酶條件培養(yǎng)3 d 的Vero 細(xì)胞經(jīng)胰酶瞬時(shí)處理,通過電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)病毒可立即從感染的細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)液中[7]。Wicht 等人為了明確胰酶在PEDV感染中的作用,通過使用非胰酶依賴株DR13(caPEDV) 構(gòu)建的反向遺傳系統(tǒng)研究分離株P(guān)EDV S 蛋白與胰酶的作用方式,結(jié)果顯示,胰酶可作用于受體結(jié)合后的wtPEDV S 蛋白并確定了Ⅰ類融合蛋白的融合亞基N 端位置是胰酶依賴性侵入細(xì)胞區(qū),暗示融合肽上游的保守精氨酸位點(diǎn)是潛在的胰酶切割位點(diǎn)[8]。 上述研究均表明,PEDV S 蛋白的激活需要胰酶的切割,胰酶在PEDV 感染和釋放中起到關(guān)鍵作用。因此,胰酶是影響PEDV 毒株分離培養(yǎng)的主要因素已獲得廣泛的認(rèn)可。

2.2 弗林蛋白酶 弗林蛋白酶(Furin)是一種類似于枯草蛋白酶的內(nèi)切酶,多數(shù)冠狀病毒在S1/S2交界處具有弗林蛋白酶的酶切位點(diǎn)。弗林蛋白酶屬于前體轉(zhuǎn)化酶家族(PC),除弗林蛋白酶外PC還有6 個(gè)可識(shí)別R/K-(X)0,2,4,6-R/K 單個(gè)或配對(duì)的氨基酸的絲氨酸蛋白酶,包括PC1、PC2、PC4、PC5、PACE4 和PC7,另外兩種蛋白酶SKI-1 和PCSK9 可裂解非堿性殘基位點(diǎn)[9]。 Li 等為了評(píng)估PEDV S 蛋白在融合激活和培養(yǎng)繁殖方面是否可用內(nèi)源的宿主蛋白酶而不使用外源的胰蛋白酶,通過取代S 蛋白中的單個(gè)氨基酸引入了弗林蛋白酶人工切割位點(diǎn),構(gòu)建了一個(gè)人工弗林蛋白酶可裂解的融合肽N 端的重組PEDV S 蛋白(PEDVSFCS),結(jié)果顯示,PEDV-SFCS能夠獨(dú)立于胰酶在培養(yǎng)細(xì)胞中復(fù)制,但是滴度相比胰酶存在時(shí)較低[10]。以上研究均表明弗林蛋白酶可以作為PEDV 感染繁殖的影響因素,但是其相比胰酶的作用效果還有明顯的差異,但卻開辟了一種PEDV 體外分離培養(yǎng)的新思路。

2.3 其他蛋白酶 TMPRSS2 蛋白酶是II 型跨膜絲氨酸蛋白酶或TTSPs 蛋白酶家族的一部分,雖然TMPRSS 蛋白酶的基質(zhì)特異性的定義尚未明確,但通常認(rèn)為其與胰蛋白酶的特異性相似。有研究顯示,TMPRSS 可在呼吸道中廣泛表達(dá)并與多種呼吸道病毒如MERS-CoV、SARS-CoV 和HCoV-229E 的激活密切相關(guān)[11]。TMPSS2 可切割A(yù)IV 的HA 蛋白并可使AIV 在無胰酶存在的條件下進(jìn)行多周期的病毒復(fù)制[12]。同樣有研究證實(shí),通過不斷表達(dá)的TMPSS2 可以裂解人偏肺病毒(Human metapneumovirus,HMPV)的融合蛋白而加強(qiáng)病毒的復(fù)制[13]。有學(xué)者利用TMPSS2 探索對(duì)同樣是冠狀病毒的PEDV 分離培養(yǎng)是否有影響。該研究使用蛋白酶抑制劑Leupeptin 處理感染可表達(dá)TMPSS2 的Vero 細(xì)胞后,PEDV 感染被強(qiáng)烈的抑制且培養(yǎng)液中病毒滴度也同樣較低。電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),用Leupeptin 處理的PEDV 感染的Vero/TMPSS2 細(xì)胞在其表面上保留了大量的病毒粒子,而在胰酶或無抑制劑Leupeptin 存在的情況下,幾乎不會(huì)形成這樣的病毒簇。由此說明,TMPSS2 對(duì)PEDV 生命周期的晚期有很重要的影響,可促進(jìn)PEDV 從感染的細(xì)胞中釋放進(jìn)入病毒液[7]。Shi 等通過對(duì)TTSPs 家族的TMPSS2、DESC1、HAT 和MSPL 蛋白酶進(jìn)行評(píng)價(jià),判斷其是否可促進(jìn)PEDV在Vero 細(xì)胞上的快速增殖,結(jié)果顯示,TMPSS2 和MSPL 可與S 蛋白進(jìn)行共定位且可被它們所裂解,促進(jìn)病毒與細(xì)胞的融合。因此,TMPSS2 和MSPL這兩種宿主蛋白酶為PEDV 在體外穩(wěn)定生長、提高病毒滴度和擴(kuò)大產(chǎn)量提供了一種新視野[14]。通過以上比較研究表明,TMPSS2 同樣具有胰酶在PEDV 感染中的作用,其可在促進(jìn)這種較難分離培養(yǎng)的PEDV 中扮演重要作用,為PEDV 的體外增殖提供一種新方法。 有研究顯示,組織蛋白酶、彈性蛋白酶和纖溶酶等一系列蛋白酶已經(jīng)應(yīng)用到冠狀病毒和禽流感病毒的體外分離感染中。PEDV 的分離培養(yǎng)也可選擇性的優(yōu)化使用多種酶源進(jìn)行輔助研究,最終建立一套穩(wěn)定的病毒分離培養(yǎng)方法。

3 pAPN

氨基肽酶N(Aminopeptidase N,APN)即CD13,是一種典型的Ⅱ型鋅金屬蛋白,廣泛存在于多種器官、組織和細(xì)胞中,密切參與到抗原遞呈、細(xì)胞分化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和冠狀病毒等病毒的侵染。研究顯示,APN 可作為HCoV-229E、FCoV 和CCoV 等冠狀病毒的感染受體,與PEDV 同屬的冠狀病毒豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)也以pAPN 為受體。廣大學(xué)者也對(duì)pAPN 是否為PEDV 受體進(jìn)行廣泛研究。多數(shù)研究者發(fā)現(xiàn),pAPN 在PEDV 的體外感染中發(fā)揮重要作用。通過其可促進(jìn)PEDV 的感染復(fù)制,推斷出其也有可能作為PEDV 的感染性受體[15-17]。但是這些研究結(jié)果仍存在諸多疑問,如PEDV 不可在含有pAPN 的ST 細(xì)胞上培養(yǎng)增殖,卻可在不含pAPN 的Vero 細(xì)胞增殖,由此說明病毒與受體結(jié)合可能并不是病毒感染靶細(xì)胞的唯一必要途徑。日本學(xué)者Shirato 對(duì)以上試驗(yàn)研究缺少以TGEV 作為pAPN 結(jié)合的陽性對(duì)照而提出質(zhì)疑,隨后通過實(shí)驗(yàn)證明pAPN 并不是PEDV 的受體,但可輕微促進(jìn)PEDV 感染[17]。Li 等使用MDCK 細(xì)胞過表達(dá)pAPN,證明該細(xì)胞只對(duì)TGEV 敏感而對(duì)PEDV 不敏感,而且與TGEV-S1 不同,PEDV-S1不會(huì)展現(xiàn)出與細(xì)胞表達(dá)的或可溶的pAPN 結(jié)合的特性。通過pAPN 預(yù)處理和CRISPR/Cas9 等試驗(yàn)均展現(xiàn)出pAPN 不是PEDV 的功能性受體。因此,通過以pAPN 作為PEDV 穩(wěn)定體外分離培養(yǎng)的功能性受體,促進(jìn)病毒的穩(wěn)定培養(yǎng)仍有待商榷[18]。PEDV 能否通過真正的功能受體促進(jìn)體外穩(wěn)定的培養(yǎng),仍需研究去探索。 pAPN 很可能是通過與PEDV S 蛋白在構(gòu)象融合時(shí)輕微促進(jìn)病毒感染,但并不能成為PEDV 分離培養(yǎng)的關(guān)鍵影響因素。

4 細(xì)胞因素

PEDV 已流行近50 年,且以經(jīng)典和變異兩種毒株共同流行,但是其穩(wěn)定分離培養(yǎng)的細(xì)胞系仍主要以Vero 細(xì)胞為常用的細(xì)胞。 研究顯示,PEDV 可在許多種屬細(xì)胞系中進(jìn)行分離培養(yǎng),如豬、猴、鴨子、貓、蝙蝠和人等[19-20]。通過添加胰酶可在人源的Huh-7 和MRC-5 細(xì)胞系培養(yǎng)PEDV 并可產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變[21]。Shi 等建立了一種新穎的PEDV 分離培養(yǎng)方法,即利用豬腸上皮細(xì)胞(IEC)分離PEDV,最終成功分離了一株P(guān)EDV NJ 株。該細(xì)胞系產(chǎn)生的CPE 比Vero 細(xì)胞更快,通過傳至45 代病毒滴度可達(dá)104.5TCID50/0.1 mL[22]。隨著研究的不斷深入,多種細(xì)胞系如PK、Hela、CPK、ESK 和MDCK 等細(xì)胞系都已廣泛的應(yīng)用到PEDV 的分離培養(yǎng)試驗(yàn)中。PEDV 雖然較難分離培養(yǎng),但其有較大的細(xì)胞嗜性范圍,因此PEDV 分離很可能不僅局限于某種條件才能促進(jìn)其穩(wěn)定培養(yǎng),而是具有一定的共性基礎(chǔ)科學(xué)問題需要解決。

5 展望

通過對(duì)我國養(yǎng)豬場疾病調(diào)查,發(fā)現(xiàn)PED 以71.79%高居發(fā)病率榜首,案例發(fā)病率可達(dá)75.47%。我國當(dāng)前主要以PEDV 變異毒株作為主要流行毒株,以經(jīng)典毒株CV777 開發(fā)的疫苗已不能有效預(yù)防該病的發(fā)生。因此,為了研制變異毒株疫苗,需要突破PEDV 穩(wěn)定分離培養(yǎng)的瓶頸和病毒滴度低等一系列問題,尋找PEDV 穩(wěn)定分離培養(yǎng)的關(guān)鍵因素迫在眉睫。 基于以上綜述分析,一直以pAPN 作為PEDV 受體的研究飽受質(zhì)疑而不能成為最有效的分離條件,但PEDV 有較廣的細(xì)胞嗜性范圍并可與胰酶等豐富的酶系統(tǒng)相互作用而利于病毒分離。希望在不久的將來能揭開外源和內(nèi)源蛋白酶在PEDV 分離中作用的神秘面紗或?qū)ふ业秸嬲绊慞EDV 分離培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。