NLRP3炎癥小體與糖尿病性心肌病研究進展

李雪蓮，李智洋，李賓公，賴性君

(1. 南昌大學第一附屬醫院心內科，江西 南昌 330006；2. 南京醫科大學，江蘇 南京 211166)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)作為糖尿病患者死亡的主要原因之一，受到國內外學者的廣泛關注。DCM的主要病理特點是心肌結構和功能的障礙，包括心肌細胞凋亡、心肌纖維化、左室功能障礙和代謝紊亂等。有研究發現[1]，心肌中的炎癥反應可能在促進DCM發生、發展中起到重要作用，特別是在心肌細胞中大量表達的核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)被發現與心肌細胞的死亡有密切的聯系。在病理因素的刺激下，多種途徑和通路激活心肌細胞中NLRP3炎癥小體的活化，進而激活下游炎癥因子，爆發級聯式炎癥反應，最終導致心肌細胞損傷。因此，了解NLRP3炎癥小體的活化過程至關重要，一方面，對DCM的發病機制可有進一步的認識；另一方面，可為藥物治療DCM提供靶點。本文收集近年來國內外文獻研究進展，對NLRP3的活化機制，以及其與DCM發病之間的聯系進行闡述。

1 NLRP3炎癥體的構成

炎癥體在機體的固有免疫反應中扮演重要角色，是由胞質內模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)參與構成的多蛋白復合物[2]。在細胞受到外界信號刺激時，位于胞質的炎癥體PRRs識別病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或損傷相關分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)，然后發生結合，從而激活下游的級聯信號。NLRP3炎性體的組成包括凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)、NLRP3及caspase-1前體3部分[3]。在外界信號刺激下，NLRP3蛋白通過其N端的熱蛋白結構域，與接頭蛋白ASC的熱蛋白結構域結合，募集pro-caspase-1，從而激活caspase-1。激活后的caspase-1介導白細胞介素-1β前體(pro-IL-1β)和白介素細胞18前體(pro-IL-18)切割活化成IL-1β和IL-18，釋放到細胞外，促使組織細胞的炎癥壞死(pyroptosis)[4-5]。

2 炎癥小體的活化與調控

NLRP3的激活可以由多種微生物產物，如二氧化硅、尿酸鹽、病原體、細胞中的ATP、β淀粉樣蛋白等引發。目前，對于NLRP3炎癥小體的活化途徑雖然存在爭議，大多數認為有3種機制。第一種機制：細胞接受刺激使得相應離子通道開放，促進鉀離子外流，介導NLRP3炎癥小體活化。第二種機制：胞外的大顆粒物質被攝入胞內，加重溶酶體負擔，使其破裂，大量破裂的溶酶體內容物釋放出來，直接刺激炎癥體的活化。第三種機制：PAMPs或DAMPs的侵入，促進胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生增多，并通過相應的通路促進炎癥小體的聚集及激活[6]。借由以上3種途徑，使游離的NLRP3變成具有生物學活性的物質，進而發揮其生物學活性。除上述途徑外，人體內還存在多種抑制NLRP3炎癥體過度活化的機制，如生理狀態下的自我調控，凋亡相關蛋白Bcl-2、COP蛋白、POP蛋白對炎癥小體活化的負性調控。還有研究發現，自噬在多個環節參與調控炎癥小體的活化過程。

3 DCM的發病機制

DCM的發病機制尚未闡明，但研究發現，氧化應激、心肌纖維化、心肌細胞凋亡、線粒體損傷、鈣離子調節失衡、心臟自主神經病變及微小RNA(microRNA，miRNA)改變等，均可能參與DCM的發生、發展[1,7]。近年來有大量研究證實，心肌持續慢性炎癥狀態可能與心肌肥大、纖維化以及心功能不全有關[8]，促進DCM的發生、發展。其中，對NLRP3炎癥小體的研究獲得了進展。研究證實，NLRP3炎性小體在抑郁癥、動脈粥樣硬化、心肌缺血/再灌注等多種疾病發病中扮演重要角色[9]。Zhang等[10]發現，NLRP3炎癥體抑制小鼠心肌成纖維細胞cAMP的表達，從而減弱心肌收縮力。而且炎癥反應通過激活NLRP3-ASC-caspase-1軸，誘導和分泌炎癥細胞因子IL-1β和IL-18等，推動了DCM的病程。NLRP3炎癥體活化在生理情況下具有感知代謝紊亂、啟動穩態調節程序的積極作用。如募集吞噬細胞、清除病原體；促胰腺β細胞增生、促進胰島素分泌釋放，使得血糖水平達到穩定狀態；維持三酰甘油等脂質代謝平衡；促進腸道微生態達到穩定，以及誘導Th2細胞分化等。當外界信號持續刺激細胞時，誘發一系列級聯反應，使NLRP3炎癥小體大量活化，從而引發過度炎癥反應。研究證實，高血糖能作為刺激信號，有效地誘導NLRP3的裝配及活化[11]，在DCM的高糖損傷及炎癥損傷中起重要作用[9]。除此之外，在糖尿病模型中，飽和脂肪酸、修飾的低密度脂蛋白、神經酰胺等，都可以促進NLRP3的活化，導致更嚴重的器官損傷和并發癥[12]。無論是在心肌細胞中，還是在浸潤的炎癥細胞中，NLRP3均參與了心肌病的發生和發展。在II型糖尿病模型鼠的心肌細胞中，可觀察到NLRP3炎癥小體被激活[1]，心肌纖維排列紊亂和心功能下降。在DCM大鼠心肌中可見NLRP3、caspase-1明顯表達，當敲除大鼠NLRP3或應用caspase-1抑制劑時，大鼠心肌纖維化減少，心功能明顯改善[13]。一磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是調控生物能量恒定的重要傳感分子，被認為是糖尿病及其心臟并發癥的重要靶點。AMPK激活后，通過激活上游激酶LKB1、CaMKKβ、Tak1等，實現降低高血糖和高血脂、減輕氧化應激水平和炎癥反應、抑制蛋白質合成等目標，從而阻止DCM的病程進展。AMPK能夠調控線粒體代謝，減少氧化應激水平，還能減少NF-κB的活化，以控制NLRP3炎癥小體活化介導的炎癥反應[14]。在DCM大鼠心臟組織和心肌細胞可以觀察到肌纖維走形紊亂，有溶解現象，有腫脹和空泡化的線粒體等細胞焦亡(pyroptosis)現象[13]。細胞焦亡是近年來廣受關注的細胞程序性死亡方式。細胞焦亡的發生機制與研究較多的細胞凋亡等形式不同，其特征是由NLRP3炎性體活化引起的caspase-1依賴性的細胞炎性死亡，表現為胞膜破裂，炎癥物質及胞外物質從孔隙釋放到細胞間質，導致細胞器及細胞質開始腫脹，直到細胞破裂死亡，隨著細胞死亡，內容物釋放到胞外，引起胞外炎癥因子的大量激活，激發更加嚴重的炎癥反應，造成嚴重的組織損傷。細胞焦亡現象的發現，證實了NLRP3炎癥小體對DCM的發病起了重要推動作用。

4 NLRP3參與DCM的發病機制

4.1 線粒體-ROS-NLRP3炎性小體線粒體是糖、脂肪、蛋白質三大物質代謝中心，為心肌細胞提供能量，線粒體功能障礙在糖尿病病理過程中起重要作用。線粒體的融合紊亂和分裂、能量代謝異常、ROS產生增加、心磷脂變化以及鈣紊亂等都促進了DCM的發展。研究發現，線粒體功能障礙與NLRP3炎癥體激活密切相關，正常生理情況下，ROS在線粒體內生成較少；高糖等外界刺激使ROS急劇增加，機體抗氧化的能力相對不足，引起大量ROS的集聚，受損線粒體釋放出的線粒體DNA(mtDNA)和線粒體ROS(mtROS)，二者作為DAMP信號分子刺激NLRP3的活化[15]。高糖作用下的心肌細胞線粒體ROS釋放增多，NLRP3炎性體活化，用Mito-TEMPO或N-乙酰半胱氨酸抑制線粒體ROS釋放后，使得心肌細胞NLRP3活化、IL-1β釋放受到抑制[16]。上述研究結果證實高糖刺激損傷線粒體，產生大量ROS是DCM中NLRP3炎癥小體活化的重要信號。

4.2 硫氧還原蛋白結合蛋白(thioredoxin-interacting protein, TXNIP)-NLRP3炎性小體未接受刺激時，TXNIP與氧化還原酶硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)結合，活性受到抑制；細胞受到外界信號刺激，線粒體ROS釋放增加時,該復合物解離, TXNIP與NLRP3(主要是LRRs結構域)結合，進而激活NLRP3炎性體，最終導致細胞因子的分泌增加[17]。有研究發現，糖尿病鼠心臟組織中TXNIP、NLRP3炎性小體及IL-1β蛋白的表達較正常鼠升高[6]。沉默糖尿病大鼠心肌細胞TXNIP的表達，可以抑制NLRP3的活化，緩解高糖導致的細胞損傷[18]。在DCM進程中，TXNIP可能作為高糖刺激與NLRP3炎性體活化之間的連接信號。

4.3 ROS-NF-κB-NLRP3炎性小體通路NF-κB是炎癥反應的重要調節因子。NF-κB誘導促炎細胞因子，如TNF-α、IL-6、pro-IL-1β和pro-IL-18在心臟組織的表達。心肌細胞在高糖刺激下可以誘導NF-κB的活化。在相應刺激下，釋放的ROS能誘使NF-κB發生磷酸化，進入細胞核內的磷酸化NF-κB能調節NLRP3的編碼基因，使NLRP3 mRNA表達增加。而且磷酸化的NF-κB還可以調控NLRP3的轉錄后水平，增加其蛋白的表達，為NLRP3炎性小體活化提供物質基礎[19]。研究發現，在DCM模型中，NF-κB磷酸化水平上升，NLRP3炎癥小體大量活化。而在使用ROS抑制劑N-乙酰半胱氨酸后，NF-κB磷酸化水平明顯下降，NLRP3的mRNA、蛋白水平表達相應降低，NLRP3炎癥小體活性也降低[13]。并且給予糖尿病大鼠腹腔注射NF-κB抑制劑，可以直接下調NLRP3炎性小體的表達及活化[19]，緩解2型糖尿病引起的心臟炎癥、纖維化，并改善心臟功能。

4.4 自噬NLRP3炎性小體通路自噬是真核生物清除損傷蛋白質、細胞器或胞內病原體，來維持細胞內穩態，實現細胞器再利用的降解過程。自噬分為非選擇性的巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬等。有研究證實，LC3或Beclin-1敲除鼠的骨髓巨噬細胞內mtROS增多，NLRP3炎癥小體大量活化、caspase-1、IL-1β表達增加[20]。使用PI3K抑制劑3-甲基腺嘌呤(3MA)抑制自噬，可增加mtROS的產生，并激活NLRP3-caspase-1-IL-1β軸[21]。以上結果表明，自噬通過抑制細胞內ROS產生，從而負性調節炎癥小體激活。線粒體自噬是細胞自噬的一種持殊形式，它主要通過自噬小體來清除功能異常的線粒體來發揮作用。心肌細胞富含線粒體，線粒體是細胞ROS的主要來源。高糖刺激下導致線粒體受損，當細胞自噬水平正常時，受損的線粒體能被及時吞噬，不引起接下來的一系列炎癥激活反應，防止心肌損傷。但是有研究發現，Ⅰ型糖尿病小鼠的心臟自噬水平受到抑制[22]，受損線粒體不能及時清除，從而釋放大量的ROS，促使NLRP3炎癥小體裝配和活化，加之活化的炎性體缺乏自噬體的吞噬，大量活化的NLRP3炎性體激活下游炎癥反應，加劇了心肌損傷。

5 NLRP3炎癥小體的藥物調控

如上所述，NLRP3炎癥小體過度激活誘發的炎癥反應參與了DCM的發生、發展，可能成為DCM新的藥物治療靶點。瑞舒伐他汀被證實在DCM模型中，通過抑制TXNIP，減少NLRP3 mRNA的表達，抑制了NLRP3炎性體活化[13]。絞股藍總皂苷在高糖環境下，可以抑制H9c2細胞線粒體細胞色素C的釋放，改善線粒體損傷，從而抑制NLRP3炎癥小體活化，改善心肌損傷[16]。丹酪酸B能提高線粒體自噬蛋白SIRT1、Parkin，促進H9c2細胞線粒體自噬水平，受損線粒體得以吞噬，ROS含量下降，NLRP3活化減少[23]。由于AMPK在控制新陳代謝中的重要作用，被認為是DCM的治療靶點，如AMPK激活劑二甲雙胍除了作為經典降糖藥，控制血糖、改善胰島素敏感性，二甲雙胍還能激活AMPK和下游的過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptors α，PPARα)，減少細胞氧化應激水平，降低ROS釋放，減少NLRP3炎癥體介導的炎癥反應[14,24]，減少心肌細胞凋亡，改善心室重構及心功能不全。AMPK激動劑的研究可能為治療DCM帶來新的方向。此外，植物提取的多酚白藜蘆醇一方面通過抗糖尿病和抗氧化作用，改善糖尿病小鼠的心臟舒張功能障礙，另一方面誘導自噬、抑制線粒體損傷，減少炎性體活化。目前的研究普遍認為，胞內K+的水平與炎癥小體的激活密切相關，細胞受損，K+外流導致NLRP3的裝配活化，而胞內β羥基丁酸乙酯可以抑制K+外流，抑制NLRP3炎癥小體活化。未來需要更多的研究，發現抑制K+外流藥物，從而從源頭上減少炎癥激活問題。H3松弛素是松弛素肽家族的一員，在體外和各種心臟纖維化模型中都具有抗炎和抗纖維化作用。研究發現，H3松弛素除了能減少糖尿病鼠心肌細胞凋亡和纖維化程度以外，還能直接抑制NLRP3炎癥體的活化，從而抑制心肌細胞損傷[25]。值得注意的是，研究發現一些miRNA的改變與DCM的發生、發展密切相關，如通過對microRNA-223等miRNA的調控，能夠下調NLRP3炎性小體活化、caspase-1的表達，從而抑制細胞凋亡。miRNA數量眾多，作用機制未被闡明，未來需要在闡明其分子機制的基礎上，開發出能夠靶向于miRNA的高選擇性、高特異性藥物應用于DCM。

6 總結與展望

由于DCM患者的高死亡率，研究其發病機制并開發靶向藥物對預防和延緩疾病的發展具有重要的意義。炎癥小體NLRP3參與了DCM炎癥反應，同時NLRP3的活化可能對心肌損傷有重要影響，NLRP3在DCM的病理生理中扮演了重要角色。盡管對其的研究取得了成果，仍有許多問題亟待解決,NLRP3蛋白激活中的大量未知機制，炎性小體與其他信號通路的交聯反應，在DCM領域仍是有限的。未來需要加深對機制的透徹研究，早日發現針對DCM的靶向藥物。