lncRNA在慢性肝病中的作用與機(jī)制研究進(jìn)展

王志敏，金歡歡，卞勉勵，開 鈞，楊 祥，邵江娟，張 峰，2，3，鄭仕中，2，3

[南京中醫(yī)藥大學(xué)1. 江蘇省中藥藥效與安全性評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2. 江蘇省中藥功效物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、3. 中藥品質(zhì)與效能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(培育)，江蘇 南京 210023]

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一組長度>200 nt，且不具有編碼蛋白功能的RNA轉(zhuǎn)錄本。曾一度被認(rèn)為與轉(zhuǎn)錄本無關(guān)，不具備生物學(xué)功能[1]。然而，近幾年科學(xué)家們研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA參與調(diào)控生命活動的每一階段，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后等水平，影響基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，調(diào)節(jié)多種下游通路，保證機(jī)體生命功能的正常發(fā)揮。但是，lncRNA的異常表達(dá)可能導(dǎo)致體內(nèi)生物學(xué)功能的紊亂，引發(fā)疾病，甚至癌癥，尤其是肝癌。目前大量研究證實(shí)，lncRNA已經(jīng)成為肝癌研究中一個新的熱點(diǎn)。

在研究肝癌的基礎(chǔ)上，基礎(chǔ)和臨床研究人員將對lncRNA的研究擴(kuò)展到整個慢性肝病上，并對慢性肝病發(fā)展的不同時期進(jìn)行探索。目前，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在肝炎、非酒精性脂肪肝、肝纖維化以及肝癌等不同慢性肝病階段都出現(xiàn)異常表達(dá)，其生理機(jī)制也逐漸被闡明。本文主要對近幾年，lncRNA在慢性肝病不同時期中的研究進(jìn)展進(jìn)行歸納與總結(jié)，為研究慢性肝病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供新思路，為尋找慢性肝病治療新靶點(diǎn)提供新方向。

1 lncRNA的概述與生物學(xué)功能

2002年，日本科學(xué)家首次提出長鏈非編碼RNA的概念，即長度大于200個核苷酸的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本[2]，這是lncRNA首次進(jìn)入人們的視野。隨后，斯坦福大學(xué)的Rinn等[3]于2007年報道了一條功能性長鏈非編碼RNA (HOTAIR)，通過修飾染色質(zhì)，參與HOX基因的轉(zhuǎn)錄。這一發(fā)現(xiàn)說明，lncRNA并非僅僅是編碼RNA的“噪音”，其有可能對整個基因的表達(dá)起到調(diào)控作用，由此，lncRNA開始成為基因研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后水平都起到一定作用，并根據(jù)lncRNA的生物效應(yīng)不同，概括為信號、誘餌、指導(dǎo)和支架4種功能[4]。信號功能指的是lncRNA能夠整合發(fā)育線索，在特定的時間和地點(diǎn)發(fā)生轉(zhuǎn)錄，因此，lncRNA是標(biāo)記空間、時間、發(fā)育階段和基因調(diào)控表達(dá)的信號。誘餌功能是指lncRNA被轉(zhuǎn)錄后結(jié)合一種蛋白質(zhì)靶標(biāo)，并使其失活，但不會發(fā)揮任何其他功能，其中，通過與microRNA結(jié)合，并調(diào)控其靶基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的作用被稱為microRNA海綿效應(yīng)，具備這種功能的lncRNA，被稱為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA ，ceRNA)。指導(dǎo)功能指的是lncRNA結(jié)合RNA結(jié)合蛋白，然后指導(dǎo)復(fù)合物定位到特定的目標(biāo)。支架功能指的是lncRNA可同時結(jié)合多種效應(yīng)器配體，將可能具有轉(zhuǎn)錄激活或抑制的效應(yīng)物在時間和空間上匯集在一起。目前，lncRNA的研究已經(jīng)在乳腺癌、肝癌、肺癌等多個領(lǐng)域開展，已經(jīng)證實(shí)的下游通路也在不斷增多，并且彼此形成網(wǎng)絡(luò)，相信隨著對lncRNA多領(lǐng)域、多層次的研究，其生物學(xué)功能將進(jìn)一步完善。

2 lncRNA與慢性肝病

基因芯片和高通量測序技術(shù)的發(fā)展，使得lncRNA在肝臟方面的研究逐漸深入[5]。H19和XIST是首次在肝臟中鑒定和研究的lncRNA，隨后又發(fā)現(xiàn)了其他兩種新型lncRNA：Meg3和MALAT-1，Meg3已經(jīng)被證明是肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中的腫瘤抑制基因，而MALAT-1在HCC發(fā)展中具有致癌作用。除此之外，還有大量的lncRNA與肝臟疾病有關(guān)，下文根據(jù)不同的疾病分類，綜合分析lncRNA與慢性肝病的關(guān)系。

2.1 慢性肝炎慢性肝炎可由飲酒、病毒感染、服用肝毒性藥物等多種原因引起。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA與病毒性肝炎關(guān)系密切，而病毒性肝炎已成為威脅人類健康的重要因素，其中乙型病毒性肝炎最為常見。目前，注射肝炎疫苗是預(yù)防病毒性肝炎的主要方式。Zhao等[6]發(fā)現(xiàn)，lnc-HULC在介導(dǎo)肝癌增殖與轉(zhuǎn)移的同時，也介導(dǎo)HBV相關(guān)性肝硬化的免疫過程。HULC的過表達(dá)，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的分化，其可能與HULC和p18的相互作用有關(guān)，提示靶向lncRNA，或許能夠促進(jìn)肝炎疫苗消滅乙型肝炎病毒。另一方面，乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)是調(diào)控乙型肝炎病毒基因復(fù)制的關(guān)鍵蛋白，抑制其表達(dá)能夠準(zhǔn)確殺傷肝炎病毒，但注射肝炎疫苗對整合病毒DNA產(chǎn)生HBx沒有影響。因此，針對肝炎病毒復(fù)制，尋找抑制HBx蛋白表達(dá)或生理過程的新靶點(diǎn)是必要的，lncRNA的出現(xiàn)為我們提供了新的思路。Zhang等[7]已證實(shí)，lnc-HOTAIR與RNA解旋酶DDX5競爭結(jié)合多梳蛋白SUZ12，并加速SUZ12的降解，SUZ12是多梳抑制復(fù)合物2(polycomb repressive complex2，PRC2)的重要亞基，而HBx激活有絲分裂polo樣激酶1(polo-like kinase 1，PLK1)介導(dǎo)的SUZ12的活化。表明lnc-HOTAIR可以干擾HBx介導(dǎo)的SUZ12活化，但其是否直接影響HBX的表達(dá)還不得而知。因此，lncRNA與病毒性肝炎的關(guān)系還不明確更多調(diào)控慢性肝炎的lncRNA還有待發(fā)現(xiàn)。

2.2 非酒精性脂肪肝由于現(xiàn)代飲食和生活方式的變化，脂肪性肝病在世界范圍內(nèi)普遍存在。肝臟脂質(zhì)積聚會導(dǎo)致脂肪肝，脂肪肝又包括酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease，AFLD)和非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)。AFLD由過度飲酒導(dǎo)致，目前還沒有發(fā)現(xiàn)與其有關(guān)的lncRNA。導(dǎo)致NAFLD的發(fā)病原因眾多，包括肥胖、胰島素抵抗、高脂血癥、代謝綜合征、動脈粥樣硬化等，但其詳細(xì)的發(fā)展機(jī)制還不清楚。

有研究人員針對lncRNA，探究NAFLD發(fā)展的具體過程與機(jī)制。值得注意的是，通過高通量測序分析高能量飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎小型豬長非編碼RNA發(fā)現(xiàn)：與正常飲食組相比，多種lncRNA差異表達(dá)，利用GO和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，其可能調(diào)節(jié)與非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)密切相關(guān)的靶蛋白編碼基因，如3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶2(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A synthetase 2，HMGCS2)、細(xì)胞色素 P450 2E1(cytochrome P450 2E1，CYP2E1)和Fos等[8]。除此之外，研究者已經(jīng)證實(shí)多個與脂質(zhì)代謝相關(guān)的lncRNA。Liu等[9]發(fā)現(xiàn)，lnc-H19在飲食誘導(dǎo)的脂肪肝中被過表達(dá)脂肪酸上調(diào)，同時也上調(diào)多嘧啶束結(jié)合蛋白1(polypyrimidine binding protein 1，PTBP1)。H19與PTBP1相互作用，以促進(jìn)其與固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein 1c，SREBP1c)mRNA和蛋白的結(jié)合，導(dǎo)致穩(wěn)定性和核轉(zhuǎn)錄活性增加。SREBP1c入核，調(diào)節(jié)脂肪酸合成酶FASN的轉(zhuǎn)錄。除H19可以調(diào)節(jié)SREBP1c外，lnc-MALAT1也可以調(diào)節(jié)SREBP1c的穩(wěn)定性，抑制其泛素化降解，但具體機(jī)制尚未闡明[10]。另外，Li等[11]發(fā)現(xiàn)了一種調(diào)節(jié)小鼠全身脂肪代謝，并在肝臟富集的長非編碼RNA(lnc-LSTR)。lnc-LSTR缺陷通過促進(jìn)組織甘油三酯(triglycerides，TG)清除率，降低TG水平。

2.3 肝纖維化肝纖維化是由酒精濫用、肝炎病毒以及其他各種病因所致的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生的過程，其主要特征是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白的產(chǎn)生和沉積增加。在肝臟中，影響纖維化產(chǎn)生的最主要細(xì)胞是肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)，在纖維化過程中，HSC活化并伴隨大量ɑ平滑肌動蛋白(ɑ-smooth actin，ɑ-SMA)、I型膠原α1(type Ⅰ collagen α1，ColIa1)的產(chǎn)生[12]。一般來說，lncRNA通過調(diào)控基因表達(dá)，影響HSC的活化與增殖，介導(dǎo)肝纖維化過程。

許多l(xiāng)ncRNA 受TGF-β調(diào)控，大量研究證實(shí)，TGF-β的過表達(dá)促進(jìn)HSC活化。有文獻(xiàn)[13]指出，在定義的共3 692個lncRNA基因座中(代表人類HSC中檢測到的所有l(wèi)ncRNA位點(diǎn))，139個lncRNA基因座被TGF-β信號誘導(dǎo)，而242個lncRNA基因座被抑制[14]。多項lncRNA的研究也指明了這一點(diǎn)。例如：He等[14]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用TGF-β1處理LX2細(xì)胞時，lnc-MEG3以時間和劑量依賴性方式下調(diào)。而過表達(dá)的MEG3促進(jìn)HSC凋亡、抑制HSC增殖，下調(diào)ɑ-SMA和ColIa1 mRNA和蛋白表達(dá)，影響纖維化相關(guān)基因mRNA表達(dá)，發(fā)揮抗纖維化作用。在非酒精性肝纖維化中，有研究證實(shí)，C-X-C基序趨化因子配體5(C-X-C motif chemokine ligand 5，CXCL5)為lnc-MALAT1在肝細(xì)胞中的基因靶標(biāo)[15]。過去研究已經(jīng)證實(shí)，肝纖維化和活化的HSC中CXCL5 mRNA和蛋白質(zhì)水平增加，因此，lnc-MALAT1或許以CXCL5依賴型的方式參與肝纖維化過程。以上結(jié)果說明，lncRNA受纖維化因子調(diào)控的同時，也調(diào)控纖維化因子，而肝纖維化的產(chǎn)生是多種lncRNA異常表達(dá)的共同結(jié)果。

lncRNA在調(diào)節(jié)肝纖維化的過程中，涉及多條通路。Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)，lnc-LFAR1活化TGF-β和 Notch信號通路，且提出TGF-β1/Smad2,3/lnc-LFAR1通路可以提供TGF-β與Notch通路的新型連接方式。而抑制lnc-MEG3的表達(dá)能夠增強(qiáng)p53蛋白表達(dá)，過多的p53轉(zhuǎn)位至線粒體外膜，與抗或促凋亡Bcl-2家族成員相互作用，誘導(dǎo)線粒體外膜透化，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放和半胱天冬酶活化，表明lnc-MEG3調(diào)控p53依賴的線粒體凋亡途徑。另外，lncRNA也參與調(diào)控與膽汁酸代謝相關(guān)的通路。膽汁酸代謝異常，導(dǎo)致高水平的膽汁酸損害膽管上皮細(xì)胞，并提高膽管內(nèi)壓力，使肝細(xì)胞暴露于高濃度膽汁酸，造成巨噬細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞死亡，誘發(fā)膽汁淤積性肝纖維化疾病。有研究發(fā)現(xiàn)[17]，lnc-H19的過表達(dá)加重了膽汁淤積性肝纖維化。在機(jī)制上，H19通過與E盒結(jié)合鋅指蛋白(E box binds zinc finger protein，ZEB1)相互作用，阻斷ZEB1與上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)啟動子結(jié)合，ZEB1抑制EpCAM啟動子活性和基因轉(zhuǎn)錄。也有文章指出，H19與小型異源二聚體(small heterodimer partner，SHP)有關(guān)，而SHP受法尼醇X受體(farnesoid X receptor，F(xiàn)XR)調(diào)控，維持肝細(xì)胞膽汁酸平衡。

2.4 肝癌HCC是我國十大最高發(fā)的惡性腫瘤之一，是由多種危險因素引起的慢性肝病發(fā)展而來。目前，lncRNA在肝癌中的作用已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA影響肝癌細(xì)胞的各種生理活動，包括肝癌細(xì)胞的增殖、自噬和腫瘤轉(zhuǎn)移與侵襲。最近發(fā)現(xiàn)，lncRNA對肝癌干細(xì)胞的自我更新有一定的影響。

2.4.1肝癌干細(xì)胞的自我更新 肝癌干細(xì)胞是肝癌組織中存在的少數(shù)具有干細(xì)胞特征的惡性腫瘤細(xì)胞，數(shù)量多且分裂速度快。肝癌干細(xì)胞的快速分裂可能是導(dǎo)致肝癌復(fù)發(fā)和耐藥的主要原因。過去已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，lncRNA在肝癌組織干細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此，lncRNA可能成為治療肝癌干細(xì)胞自我更新的新靶點(diǎn)。

lncRNA多通過表觀遺傳修飾的方式，影響相關(guān)通路的傳導(dǎo)，而Wnt/β-catenin是調(diào)控肝癌干細(xì)胞自我更新和致瘤性的主要信號通路。多項研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA對肝癌干細(xì)胞的調(diào)控與β-catenin信號相關(guān)，例如：lnc-DANCR可能與CTNNB1的3'-UTR競爭性結(jié)合，以阻斷miR-214和miR-320a介導(dǎo)的CTNNB1抑制，發(fā)揮ceRNA的作用，增加β-catenin蛋白表達(dá)，促進(jìn)肝癌干細(xì)胞在HCC中的擴(kuò)增[18]；另有研究發(fā)現(xiàn)，lnc-β-Catm募集組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶，促進(jìn)β-catenin甲基化[19]。除影響Wnt信號通路外，lncRNA還影響JAK2/STAT3信號通路。最近研究發(fā)現(xiàn)，lnc-DILC在肝癌干細(xì)胞中低表達(dá)，通過抑制JAK2/STAT3信號通路，抑制肝癌干細(xì)胞的擴(kuò)增。繼續(xù)研究上游通路發(fā)現(xiàn)，lnc-DILC與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB競爭結(jié)合IL-6的啟動子，抑制IL-6的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控JAK2/STAT3信號通路[20]。

2.4.2肝癌細(xì)胞 目前，已在肝癌中發(fā)現(xiàn)大量1ncRNA異常表達(dá)，且這些1ncRNA通過調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞增殖、自噬、凋亡、遷移與侵襲，起到致癌或抑癌基因的作用。在肝細(xì)胞增殖方面，已有研究發(fā)現(xiàn)，lnc-ANRIL在HCC組織中上調(diào)，而lnc-ANRIL表達(dá)降低可抑制HCC細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，并誘導(dǎo)凋亡[21]。Ma等[22]在此基礎(chǔ)上通過一系列的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，lnc-ANRIL作為miR-122-5p的分子海綿，敲低后，抑制HCC細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移和侵襲。lncRNA 還具有分子支架作用。有研究發(fā)現(xiàn)，lnc-HULC是YB-1蛋白與細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)的分子支架。YB-1是平滑失活的信使核糖核蛋白顆粒(messenger ribonucleoprotein granules，mRNPs)的主要組成部分，維持mRNAs靜止?fàn)顟B(tài)。事實(shí)上，HULC可以促進(jìn)YB-1蛋白的磷酸化，從而導(dǎo)致YB-1從其結(jié)合的mRNA中釋放。因此，靜止的致癌基因mRNA的翻譯將被激活，包括細(xì)胞周期蛋白D1、細(xì)胞周期蛋白E1、MMP-3等，調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移[23]。在肝癌細(xì)胞凋亡方面，Chen等[24]發(fā)現(xiàn)，lnc-MEG3以p53、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激兩種方式，介導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。事實(shí)上，MEG3的異位表達(dá)增加p53以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白78-ku葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(ER stress-related protein 78-ku glucose regulatory protein，GRP78)、肌醇需求酶1(inositol demand enzyme 1，IRE1)、RNA依賴蛋白激酶樣ER激酶(RNA-dependent protein kinase-like ER kinase ，PERK)、激活轉(zhuǎn)錄因子6(activation of transcription factor 6，ATF6)等的表達(dá)，但具體機(jī)制不明。在肝癌細(xì)胞自噬方面，Xiong等[25]發(fā)現(xiàn)，lnc-HULC可以通過穩(wěn)定Sirt1蛋白，誘導(dǎo)自噬。Sirt1已被證實(shí)參與調(diào)控Atg5、Atg7、Atg8、Beclin I、FoxO1、p53等關(guān)鍵蛋白，誘導(dǎo)自噬。其主要通過阻斷miR-6825-5p、miR-6845-5p 和miR-6886-3p對USP200的抑制作用，導(dǎo)致與Sirt1形成的復(fù)合物增加，減少Sirt1泛素化降解。但熒光素酶報告基因結(jié)果表明，HULC并不是作為ceRNA減弱3種microRNA對USP200的抑制作用，具體機(jī)制還有待探究。

3 結(jié)語與展望

綜上所述，lncRNA 在肝癌的研究中較為成熟，如lnc-HULC、MALAT1、HOTAIR等涉及肝癌發(fā)生的多條通路，介導(dǎo)多種細(xì)胞生理過程，而在肝炎、酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、肝纖維化方面研究還不具體，雖然通過測序已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與多個lncRNA相關(guān)，但并沒有對其鑒定和機(jī)制研究。從已有的文獻(xiàn)可以看出，不同的lncRNA或許能夠介導(dǎo)相同的通路，例如多個lncRNA介導(dǎo)Wnt/β-catenin通路，調(diào)控肝癌干細(xì)胞自我更新；在NAFLD中，lnc-H19與lnc-MALAT1共同介導(dǎo)SREBP1c的穩(wěn)定性。說明不同lncRNA之間存在彼此串聯(lián)的可能性，這或許能成為研究lncRNA的新思路。另一方面，lncRNA 與microRNA關(guān)系十分密切，尤其是在肝癌的研究中，提出了多條lncRNA-microRNA軸。ceRNA和海綿效應(yīng)的提出，也證實(shí)了這一點(diǎn)。不過，microRNA也可以反過來影響lncRNA的轉(zhuǎn)錄，兩者的相互作用還有待于進(jìn)一步深入研究。總之，lncRNA的出現(xiàn)為我們研究肝臟疾病、開發(fā)治療藥物，提供了新策略和新方法。雖然，lncRNA與肝臟疾病關(guān)系的研究已經(jīng)取得了一定的成績，但具體的機(jī)制不清晰和新問題的不斷提出，都對我們的研究提出了更高的要求。