生鮮乳中微生物檢測技術研究進展

趙艷坤，陳賀，王帥，王富蘭，蔡建星，王成

（新疆農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，農業部農產品質量安全風險評估實驗室（烏魯木齊），新疆農產品質量安全實驗室，烏魯木齊 830091）

隨著人們對高水平生活的向往和追求，乳品的需求量不斷增加，人們對乳品的關注不止在于其豐富的營養價值，更傾向于乳品質量安全問題。生鮮乳作為乳制品的源頭，其全價的營養成分為微生物提供了理想的生長繁殖條件，有害微生物的污染成了優質生鮮乳的最大危害，這不僅影響乳品質量安全，也關乎著整體乳業的健康發展。因此，對生鮮乳中微生物進行安全、高效、便捷的檢測對奶業綠色發展及人類健康具有重要意義。

1 微生物學檢測技術現狀

多年來，多數企業、乳品產商及質檢部門采用傳統方法檢測乳品中微生物，主要對普通活菌總數進行測定，包括標準平板計數（Standard plate count method，SPC）和顯微鏡直接觀察（Direct microscopic observation，DMC）兩種方法。傳統檢測方法雖具有所需設備簡單易操作和低成本的優點，但多依賴操作人員的主觀判斷能力，并不能完全鑒定出乳品中某些細菌[1]，數據的可靠性及結論的正確性難以保證，且操作過程繁瑣、周期長、費時費力，無法滿足大批量檢測和處理突發事件的需要。為實現快速檢測目的，有研究者建立了皿膜系統、疏水網格濾膜（Hydrophobic grid mesh filter，HGMF）法、螺旋板系統等，這些優化的檢測方法均一定程度上提高了操作效率，尤其是HGMF法能濾去樣品中的抑制因子，使其在轉移過程中不需進行懸浮處理，避免了菌體受到物理破壞，可對沙門氏菌、大腸菌群、霉菌及酵母菌計數，在生鮮乳和巴氏殺菌乳的質量管理中被廣泛應用[2]。

2 物理生化技術

2.1 電阻抗法

微生物在培養基中生長繁殖時，可將培養基中的碳水化合物、蛋白質、糖、脂肪等營養物質新陳代謝為氨基酸、乳酸等小分子物質，這個過程使培養基的導電性能增強而電阻抗性降低，因此可通過測定培養前后培養基的電阻抗變化情況來判定微生物數量和生長等[3]。目前，電阻抗法在食品微生物快速檢測中已較為普遍，但在生鮮乳中的應用研究還較少。Bancalari等[4]利用電阻抗法測量電導率變化來追蹤牛奶中微生物的生長情況，結果顯示阻抗的擬合曲線與細菌生長曲線高度一致，說明電阻抗法完全適用于牛奶中微生物的檢測。國內早有學者證明了電阻抗方法檢測牛奶中細菌總數的可行性，較傳統檢測方法，可大大縮短檢測周期。近年來，杜寒春等[5]建立了電阻抗法快速測定牛乳中菌落總數的方法，檢測限為101～107cfu/mL，得到的阻抗檢測時間與菌落總數的標準曲線方程為y=-0.5923t+9.4172，相關系數r=-0.9907，可信度高。

與直接滴定（GB）法相比，電阻抗法簡便易操作、耗時短、結果準確可靠，且適用于不同時期、不同來源、不同酸度的產品，實用性更強，但其靈敏度易受樣品菌落總數濃度影響，檢測時間和檢測限不一定精準。另外，由于國內阻抗儀器質量尚有待改進，其成本偏高，該方法目前尚未普及于生鮮乳中微生物檢測的應用。

2.2 快速測試片法

快速測試片法是指以紙片、紙膜和膠片等作為培養基載體，將特定的培養基和顯色物質附著在上面，通過微生物在上面的生長特征和顯色反應來測定乳品中微生物的方法[6]。研究報道，一種適用于檢測乳品中大腸桿菌的快速試紙片，最低檢出限達到4cfu/mL，檢測結果與GB法相比符合率高于96%[7]。美國3M公司研發的Petrifilm測試片是一種商品化較成熟的菌落測試片，因其自身配有培養基，待測樣品則不需增菌，準確性高，在乳品微生物現場檢測中具有很大優勢，且能夠區分大腸菌群中的大腸桿菌和其他成員[8]。梁春梅等[9]使用快速測試片法對生鮮乳、酸奶、純牛奶等樣品進行菌落總數測定，結果發現快速測試片的準確性、特異性、靈敏度、穩定性等各項指標與國標方法（GB4789.2-2010）檢測結果差異不顯著，具有高度一致性，可提高乳制品中菌落總數的檢測效率。

該檢測方法簡便易行，費用低，適合現場采樣檢測，可在短時間內迅速對樣品進行初篩，但由于空間有限，會因受細菌代謝產物的影響和待測樣品中復雜成分的干擾，使菌落之間相互粘連，導致計數不準。

2.3 三磷酸腺苷（ATP）生物發光技術

ATP濃度能夠反映存在的活體微生物數量[10]。Niksic等[11]將該法與GB法進行比較，證明了二者具有高度相關性。在國外，ATP技術已經廣泛應用于乳品工業，如生鮮乳活菌數檢測、UHT乳活菌數檢測等[12]。國內學者也對此技術有了較成熟的探究，如：陸燁等[13]通過ATP生物熒光技術快速測定細菌總數的實驗，發現大腸桿菌等三種細菌的檢出菌數對數值與ATP值的對數值之間呈線性關系，相關系數R2=0.961；王慧榮等[14]采用改進的ATP生物發光技術快速測定活菌量，結果表明ATP檢測限為0.001nM，活菌ATP濃度與平板計數的菌落總數結果差異不顯著，具有一定線性相關性。雖然此方法有操作簡單、檢測快速、范圍廣、攜帶方便、可在線檢測、檢出率高等優點，但仍存在不能分辨非微生物中含有的ATP缺陷，會因生鮮乳等新鮮樣品中含有大量游離ATP和體細胞而導致檢出限較低，同時易受鹽等成分的干擾。

3 免疫學技術

3.1 酶聯免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA的基本原理是將抗原或抗體作為試劑用酶進行標記，將其固定于固相載體表面，保持其免疫原性，在載體上將酶染色后通過酶催化底物使其生成有顏色的產物，產物的量與樣品中待檢物質的量成一定比例，通過測量產物的量對待檢樣進行定性和定量。ELISA能夠實現大批量樣品的同時檢測（96孔），檢測限一般在105cfu/mL。王文彬[15]報道稱對于食源性致病菌等大分子的微生物，一般采用雙抗體夾心ELISA進行檢測，靈敏度高且檢測數據可靠。國外對食源性致病菌免疫檢測方法的研究已較為成熟，其中ELISA檢測方法受到廣泛關注。最新研究發現，通過建立一種高靈敏度、特異性的ELISA系統，能夠用于檢測牛奶、肉類和大米中的金黃色葡萄球菌，得出ELISA可用于微生物菌群的免疫檢測的結論[16]；Arenas等[17]利用ELISA對16家采用不同抗生素的畜牧場奶牛中大腸桿菌和金黃色葡萄球菌造成的食物污染進行了檢測，結果發現有75%的農場受到這些食源性致病菌的污染。

綜上，ELISA用于檢測乳制品等各種樣品中食源性致病菌的通用性較好，在保證檢測準確性的前提下，與其他方法相比，ELISA具有方便快捷、低成本的優點，但抗體的特異性、抗原與抗體的濃度和反應液會影響檢測結果，當檢測污染較嚴重的樣品時，會受到其他細菌的影響而降低其檢測特異性。因此，此方法適用于企業、基層檢驗機構等有關食品中食源性致病菌的檢測。

3.2 免疫熒光技術（Immunofluorescence technique，IFT）

免疫熒光技術（Immunofluorescence technique，IFT）也稱熒光抗體技術，主要原理是用熒光素標記抗體，然后與待檢樣品中的抗體特異性結合，產生的熒光強度與待測物質的濃度呈線性關系，根據計算得到待測樣品含量。IFT作為一種新型檢測技術，除用于檢測大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等食品致病菌，還可被用于沙門氏菌、志賀氏菌、單增李斯特氏菌等多種致病菌的檢測[6]。雖然IFT檢測時間短、效率高、靈敏度高，但是抗體價格較貴，成本高，技術性程序較復雜，易發生交叉感染，出現假陽性，難以進行大規模普及使用，目前，IFT在乳制品行業的應用報道較少，有待進一步探究。

4 分子生物學技術

4.1 PCR技術

聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是能使微生物在體外迅速擴增特異目標基因的一種技術。此技術無需培養，直接取樣檢測，快速、靈敏，可以大大縮短檢測時間，尤其是對于食品中存在較少且規定不得檢出的致病菌具有獨特的優勢，已廣泛應用于食品、醫藥、環境監測等領域的微生物監測。由于其可以將低濃度微生物進行大量擴增，因此增加了微量濃度微生物被檢出的可能性，但是檢測之前需要知道待檢微生物的核酸序列，對于未知核酸序列的微生物較為局限，定量檢測能力稍差，如果和熒光定量相結合則較完美。閆晗等[18]建立了多重PCR檢測方法，實現了對乳品中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的同時檢測，較國標方法縮短了12～24h。研究表明，熒光定量PCR技術不僅可以檢測出多種細菌，且能準確鑒定出它們的種和亞種間的基因序列，以此為辨別它們的親緣關系[19]。劉艷艷[18]采用熒光定量PCR法對500份鮮乳樣品中細菌總數進行檢測，實現了對生鮮乳中污染細菌種類的鑒定，并建立了污染細菌譜，進一步對100份生鮮乳樣品同時運用國標法和熒光定量PCR法檢測，驗證了PCR法檢測細菌的準確性在90%以上，檢測時間在4 h左右，得出結論：熒光定量PCR是一種快速檢測鮮乳細菌總數的新方法，能夠為生鮮乳樣品的質量等級進行快速的確定。Sartori報道指出美國乳品科學協會最新開發了一種對牛奶樣品中金黃色葡萄球菌的實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測方法，發現RT-qPCR能夠快速檢測出靶細菌，相比于國標法，檢測特異性敏感性為100%，且能夠準確排除其他基因型和細菌種類，排他性達98%，揭示了RT-qPCR作為一種檢測微生物的新途徑，能夠簡單明了對目的細菌進行檢測，非常適用于乳品等各種樣品的常規微生物檢測[20]。

4.2 核酸雜交技術

核酸雜交技術是在堿基配對的基礎上使用核苷酸探針與靶基因特異性進行生物測定的一種標準技術，通過分子雜交與目的基因結合，產生雜交信號，能從龐大的基因組中顯示出目的基因是一段帶有檢測標記，且有順序已知的與目的基因互補的核酸序列（DNA或RNA）[21]。

核酸雜交技術中使用較廣泛的是熒光原位雜交技術（Fluorescence in situ hybridization，FISH），FISH通過熒光素標記探針并進行雜交，對雜交點進行熒光強度的測定便可得到特定核苷酸序列及其含量。Barrero等[22]利用FISH技術對大腸桿菌基因進行特異性檢測，結果不到6h，其靶基因和rRNA基因即被檢測出，充分顯示了其檢測效率。核酸雜交技術正是由于熒光物質的使用提高了分辨率，確保了足夠的靈敏度和特異性，操作簡便，能夠快速檢測出待測樣品中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等微生物的成分及含量，但遺憾的是每檢測一種微生物就需要一種探針，成本較高，難以對待測樣品中多種污染菌實現一次性或連續性檢測，應用范圍有限。

4.3 基因芯片技術

近年來，基因芯片技術是發展迅速的一項高新技術，現階段在各個領域被各國學者高度重視，成為時下研究熱點，已有大量研究工作及成果，但仍有部分問題需進一步探討?；蛐酒夹g是將設計好的基因片段或寡核苷酸單鏈序列固定于芯片上，形成二維DNA探針陣列，待檢微生物DNA經過PCR擴增后形成熒光標記分子，再與芯片上的寡核苷酸點進行雜交，然后通過熒光波長掃描儀定量分析待檢樣品中是否含有目標微生物及其含量。目前，已廣泛應用于各種食品微生物檢測。最新研究報道稱，基因芯片還可用于測定乳品中藥物殘留。基因芯片技術具有速度快、精準度高的優點，能夠檢出待測樣品中可能存在的多種微生物成分和致病菌，甚至可識別死菌的DNA，但此方法需一定專業技術且難度較大，目前在我國乳品安全檢測技術中尚未形成一定的應用規模。

4.4 流式細胞儀

流式細胞儀（Flow Cytometry, FCM）是以激光做為光源，通過檢測光散射信號和熒光信號強度，推測出微生物的大小、形狀和數量。FCM曾在第二次世界大戰中用于細菌和孢子的檢測，隨著儀器光學系統的改進及新熒光素的發現，近年來，FCM在微生物學的應用發展迅速。研究報道，FCM能夠鑒定食品中微生物的活性，可快速鑒別并計算死/活細胞數目，由此可以評價食品的殺菌效果及有益菌的含量[23]。有研究證實，FCM可檢測生鮮乳等食品中致病菌含量，且FCM計數的檢測時間僅為1h[24]，能夠滿足批量樣品在線檢測需求，較平板計數法大大縮短了檢測用時，此外，FCM的靈敏度更高、更準確。近期，國外研究者發現FCM技術可用于金黃色葡萄球菌等致病菌的檢測，為某些疾病的診斷提供一種快速有效的檢測方法[25]。楊莉婷等[26]建立了FCM快速檢測并計算生鮮乳中細菌總數的方法，與國標檢測方法相比，相關性分析顯示兩者呈直線相關（r=0.9802），極顯著相關（P＜0.01），檢出限為101cfu/mL，證明了FCM技術具有更高的準確性和靈敏度；另外，Langerhuus等[27]利用FCM技術對乳房炎乳中革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌進行檢測，結果發現FCM可快速識別乳樣中的革蘭氏陰性菌，靈敏度為1，特異性為0.74，為由革蘭氏陰性菌引起的乳房炎抗菌治療提供了一種新途徑。然而，FCM仍有一些弊端，如使用成本過高，只能檢測液態樣品，且由于對待測液體樣品有比較嚴格的要求，任何與目標物粒徑相近的微粒都可能影響檢測結果，而生鮮乳中的蛋白質顆粒、脂肪球、體細胞等成分會干擾FCM對目標物的篩選及確認，因此，FCM技術在生鮮乳微生物檢測方面的主要問題是清除這三種干擾成分。

5 展望

隨著現階段乳制品工業的迅速發展及乳品質量安全意識的普遍提高，傳統的微生物檢測方法已不能滿足需求，在現代發達的科學技術基礎上，建立和完善安全、高效的微生物檢測方法對確保生鮮乳質量安全及促進乳品工業科技進步具有重大意義。綜上所述，近年來國內外開發了多種微生物安全檢測技術方法，今后在乳品業有著非常廣闊的應用前景?？傮w分析可知，這些方法相比于傳統方法，雖解決了檢測時間問題，但在檢測敏感性、特異性及操作等方面各有利弊，因此為了提高生鮮乳微生物檢測率，確保乳品質量安全，現實檢測過程中常將多種方法結合使用。此外，不難發現，這些新型檢測技術的成本較高，這也是其不能成為各機構和基層實驗室普遍使用的檢測方法的重要原因之一，但是生鮮乳的質量關乎著乳品安全，與消費者的健康和生命安全息息相關，所以，筆者呼吁我國乳品安全檢測相關部門有必要加強對生鮮乳微生物安全檢測技術的投入力度，為乳品安全創造一個良好的環境氛圍。同時，為了能真正實現準確性好、靈敏度高、低成本和快速的微生物智能檢測，我們仍需不斷克服實際應用中遇到的困難和挑戰，加強研究力度和深度。