家畜精液冷凍保存的抗氧化研究進展

王麗云，李艷華，王彥平，麻柱

（1.北京奶牛中心，北京 100192；2.農業農村部奶牛遺傳育種與繁殖重點實驗室，北京 100192；3.奶牛遺傳育種與繁殖北京市重點實驗室，北京 100192）

1 氨基酸類

氨基酸是構成動物營養所需蛋白質的基本物質。其中丙氨酸、半胱氨酸還具有抗氧化、抗菌、解毒等作用，在醫學上用作治療由于缺精、少精所致的男性不育癥。在國外已有將半胱氨酸用作牛冷凍精液營養劑和保護劑的報道[1,2]，國內胡傳活等將丙氨酸、半胱氨酸等氨基酸添加到牛冷凍稀釋液中取得一定的進展[3]。

1.1 丙氨酸

丙氨酸是構成蛋白質的基本單位，在生理代謝過程擔任著重要角色，作為多種活性物質的中間代謝產物，有抗疲勞、抗衰老的作用。另外，丙氨酸還是某些生物抗凍蛋白的主要成分，而抗凍蛋白可以降低體液的冰點，減少冷凍過程中冰晶的生成[4～6]。正是由于丙氨酸具有以上生理機能，胡傳活等將丙氨酸添加到牛冷凍精液稀釋液中后發現冷凍后精液活力有一定提高[3]。但是國內將丙氨酸作為抗氧化劑用于冷凍精液稀釋液的研究較少，需要更進一步地研究加以論證。

1.2 半胱氨酸

半胱氨酸其巰基可以使蛋白質保持穩定性，具有抗氧化作用，能夠在冷凍過程中保護精子質膜免受氧化損傷[7]。Bilodeau等[1]在牛冷凍精液中加入0.5μmol/L半胱氨酸結果可以使精子活力提高。有研究表明，牛冷凍精液生產過程中添加2mmol/L半胱氨酸能有效保護線粒體和精子頂體完整性。胡傳活等[3]將半胱氨酸添加到牛冷凍精液稀釋液中，結果精子活力未有明顯提高，但精子畸形率顯著低于對照組。關于添加半胱氨酸的時機和劑量還需要進一步探討。

2 維生素類

2.1 維生素E

維生素E又稱生育酚，是一種脂溶性維生素。維生素E對線粒體磷脂以及網狀組織磷脂等有很強的親和力，與細胞膜上的磷脂結構相結合，可阻止脂質過氧化反應的發生從而保護精子。它是一種非常有效的預防脂質過氧化反應的抗氧化劑。維生素E具有抗氧化作用，能維持精細胞膜的穩定性。趙憲林[8]研究發現，在秦川牛冷凍精液稀釋液中添加一定量維生素E可以提高精液中抗氧化酶（CAT,SOD等）的活性，并能夠提高精子活力和頂體完整率。另有許多研究也驗證了這一結論[9,10]。

2.2 維生素C

維生素C又稱抗壞血酸，是水溶性維生素，具有強還原性，其抗氧化作用是通過直接消除ROS而產生的。權富生等[11]研究表明，在綿羊冷凍精液稀釋液中，添加一定濃度的維生素C有效提高了精液品質。還有研究發現，維生素C能提高精清中抗氧化酶的活性，并且能顯著改善精液品質[12]。

2.3 維生素B12

維生素B12又名鈷維生素，是目前發現的惟一含有金屬元素鈷的維生素。其通過減少組織的耗氧量，從而達到提高機體對氧的耐受性的效果。趙憲林在牛冷凍精液中添加維生素B12，發現情期受胎率有明顯的提高[8]；張磊[13]也證實了這一點。姚桂東等[14]發現B族維生素能提高精子的受精能力。孫淑琴[15]發現添加維生素B12能顯著提高精子的活力和頂體完整率。有研究發現將維生素B12用于牛羊的冷凍精液可以提高凍后的精子活力[16,17]。

3 酶類

3.1 過氧化氫酶（CAT）

過氧化氫酶是一種抗氧化酶。它可以減弱或消除H2O2對細胞的毒害作用，即將H2O2分解成H2O和O2，是一種組成生物體內防御體系的關鍵酶。過氧化氫酶廣泛存在于動植物以及微生物中，其酶促反應為機體提供了抗氧化能力。研究表明，外源性過氧化氫酶的添加可阻止ROS的過氧化損傷。霍敏在絨山羊冷凍精液稀釋液中添加過氧化氫酶，結果發現凍后精子活力、質膜完整率等均有顯著提高[18]。

3.2 超氧化物歧化酶（SOD）

超氧化物歧化酶能將氧離子轉變為弱毒性H2O2，而H2O2通過生物體內過氧化氫酶的作用分解成水和氧，以發揮其抗氧化性。余波瀾等的研究表明精液中SOD的含量與精子的活力呈正相關[19]。程舸等研究發現低溫保存的牛精液中超氧化物歧化酶的活性明顯降低[20]，徐振軍等[21]對凍前和凍后小尾寒羊精液和精子中的SOD活性精細研究，發現冷凍對SOD造成很大的損傷。因此在冷凍精液稀釋液中添加外源性的SOD，能保護精子免受過氧化損傷。劉超等[22]研究結果表明，山羊精液中添加SOD能有效提高精子的活力。

4 其他

4.1 谷胱甘肽（GSH）

谷胱甘肽（GSH）是細胞內含有巰基的非蛋白化合物，它通過巰基發揮抗氧化作用，是動物體內重要的抗氧化劑和一些自由基清除劑。氧自由基對精子具有特別大的影響，而GSH可與氧自由基結合直接加以清除；有研究證明射出后精子與附睪處的精子比較，谷胱甘肽含量大大降低，如要保護體外精子就需要大量的GSH進行抗氧化作用。Stradaioli[23]研究發現谷胱甘肽能夠有效提高凍后精子活力。吳大平[10]研究表明適量添加GSH可以提高地中海水牛凍精活力，保護質膜完整率并能降低精子的畸形率。

4.2 丙酮酸鹽

丙酮酸鹽是三大營養物質代謝的樞紐，是細胞的能源物質。丙酮酸鹽具有多細胞/組織的保護功能，除了能夠抗疲勞、降血脂、保護心肌，還有極好的抗氧化性。有研究表明，丙酮酸能抑制體內氧自由基的氧化作用[24]，還是一種過氧化氫清除劑，具有防止過氧化損傷的作用。國外將丙酮酸鹽應用于動物精液的低溫冷凍保存[25～28]的研究很多，國內的研究相對較少。胡傳活等[29]在牛冷凍精液稀釋液中添加丙酮酸鹽發現凍精品質有一定的提高。

4.3 褪黑素（MLT）

褪黑素是一種胺類激素。褪黑素及其代謝產物可以直接清除活性氧，抑制細胞內促氧化酶活性。褪黑素是減少細胞氧化損傷最有效的物質之一，可直接通過抑制氧化反應來保護細胞膜脂質結構、核酸、蛋白質等；也可以通過激活體內過氧化物酶而間接發揮抗氧化作用。楊寶衛等研究發現褪黑素能有效降低凍后豬精子的畸形率，并能提高活力[30]。李方舟等[31]發現褪黑素能夠提高低溫保存的羊精液品質和存活時間。吳大平[10]研究表明，在水牛精液冷凍稀釋液中，添加褪黑素可以降低精子的畸形率，提高凍后精子活力。吳美靈[32]發現褪黑素能夠提高安格斯牛冷凍精液活力和質膜完整率。

5 小結與展望

抗氧化劑可利用其保持蛋白穩定性、消除過氧化氫、消除活性氧、與膜上磷脂相結合、抑制促氧化酶活性等特性來保護精子免受過氧化損傷，保持質膜完整性，降低精子凍后畸形率，提高精液凍后品質。因此添加外源抗氧化劑在精液保存應用研究中有廣闊的前景，其對于加速精液冷凍保存技術的發展，提高優秀種畜的利用率都具有重大的意義。基于目前研究中所取得的一些進展，進一步深入研究，必將在冷凍精液保存技術上取得重大突破。