乙酰羥酸合酶抑制劑類除草劑的植物抗性機制

徐倩玉 蘭 玉 劉嘉欣 周新宇 張 剛 鄭志富,*

1 浙江農林大學農業與食品科學學院,浙江杭州 311300；2 浙江農林大學林業與生物技術學院,浙江杭州 311300；3 文登市佳禾種業有限公司,山東威海 264400

過去半個多世紀,農作物產量的提高取決于種質資源的改良和作物栽培模式的改善?，F代農業化學諸如高效除草劑、殺蟲劑和殺菌劑的開發與利用給目前的作物栽培模式帶來新的機遇和挑戰[1-3]。在一些國家,除草劑的應用使雜草危害導致的產量損失下降20%以上[4],但是同類除草劑的長期使用卻引發抗性雜草的產生、后茬作物的藥害和土壤微生物種群的變化,并且在某種程度上因除草劑在土壤中的積累量增加影響諸如花生果實等地下收獲器官的品質[5-10]。目前普遍認為,要克服上述不良影響,必須輪換使用多種不同的高效除草劑,并創制對多種除草劑具有抗性的一系列作物品種,以及建立多樣化的作物栽培模式。

本文將從以下三方面分析國內外研究現狀以及未來發展動態,以期為農作物除草劑抗性性狀的遺傳改良和開發應用提供參考。

1 AHAS 抑制劑類除草劑的類別與特點

AHAS 酶存在于所有已知的植物中,在植物的生長發育中起著重要作用[11]。它的活性隨植物的種類、器官和組織以及發育階段的不同而變化[12-14]。一般情況下,植物分生組織中AHAS 活性最高[15-16]。AHAS 作為除草劑的作用靶標,酶活性的喪失將導致植物中支鏈氨基酸(BCAAs,branched-chain amino acids)的合成受阻、植物代謝紊亂、最終植物生長受阻甚至死亡。此外,因為哺乳動物缺乏由AHAS 介導的支鏈氨基酸合成途徑,因此AHAS 抑制劑對人和動物相對安全[17]。于是,AHAS 抑制劑的研究一直是高效除草劑開發領域最為活躍的熱點之一。

目前已被廣泛用于農業生產中的AHAS 抑制劑有5 類,分別為磺酰脲類(Sulfonylureas)、咪唑啉酮類(Imidazolinones)、三唑并嘧啶類(Triazolopyrimidines)、嘧啶硫代苯甲酸類(Pyrimidinylthiobenzoates)和磺酰胺羰基三唑啉酮類(Sulfonylamino carbonyltriazolinones)[18]。這些類別的除草劑彼此結構不同,且與AHAS 的底物結構缺乏相似性,因而目前普遍認為AHAS 抑制劑不大可能與底物競爭活性位點,應屬AHAS 的非競爭性抑制劑[18]。除草劑活性的高低取決于對AHAS 的抑制強度,酵母和擬南芥等AHAS 的晶體結構分析顯示磺酰脲類和咪唑啉酮類抑制劑與酶形成復合物后可阻斷酶的底物進入酶活性位點,從而起到了抑制作用,這很好地解析了為何除草劑的分子結構與酶的底物不相似,卻仍然能夠有效地降低酶的活性。這些抑制劑具有專一性或選擇性強的特點,能夠阻礙某些雜草的生長,但對特定農作物沒有明顯的抑制活性,除草劑對雜草和作物的選擇性主要是由不同植物對降解除草劑和去毒化效力的差異以及吸收和輸導的差異導致的[18-20]。

2 AHAS 靶酶的特性及其在支鏈氨基酸合成中的作用

纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸,統稱為支鏈氨基酸(BCAAs),它們可在植物與微生物中合成,但動物缺乏相應的合成途徑。已知有4 種酶參與BCAAs的合成,即乙酰羥酸合酶(AHAS)、酮酸還原異構酶、二羥酸脫水酶和轉氨酶。在植物研究領域,AHAS 又稱乙酰乳酸合酶(acetolactate synthase,ALS),是BCAAs 生物合成途徑中催化第一步反應的關鍵酶。它催化2 個平行反應,在纈氨酸和亮氨酸合成途徑中,此酶催化縮合反應將2 分子丙酮酸轉化為乙酰乳酸,行使乙酰乳酸合酶的功能；而在異亮氨酸的合成過程中,這種酶催化1 分子丙酮酸與1 分子丁酮酸生成2-乙酰羥基丁酸,故稱乙酰羥酸合酶[18,21]。

植物AHAS 是核基因編碼的質體酶。在所有已知的植物中,AHAS 均含質體向導序列,相應地,人們只在植物細胞的質體中檢測到AHAS 的活性。AHAS 酶由2 種亞基即催化亞基和調節亞基組成,在植物中AHAS 以八聚體形式存在,含4 個催化亞基和4 個調節亞基[22]。其中大亞基含ThDP,單獨存在時仍然具有活性,故被稱為催化亞基；小亞基自身無AHAS 活性,但起著調節催化亞基的作用,因此被稱為調節亞基。植物AHAS 的催化亞基和調節亞基是由不同基因編碼的,各自的基因數目隨物種而異。譬如,擬南芥含1 個編碼催化亞基的基因,甘藍型油菜則含5 個相應基因?，F有大量鑒定催化亞基基因的報道,而調節亞基的基因克隆研究則局限于少量諸如煙草、擬南芥等物種[23-25]。

AHAS 的一個顯著特點是其活性受產物反饋抑制調控,小亞基在該過程中發揮重要作用。植物中的AHAS 調節亞基比細菌和真菌中的相對應亞基要大很多,人們猜測它含2 個調節位點,1 個用于亮氨酸,另1 個用于纈氨酸或異亮氨酸[18,23-24]。于是,每一個支鏈氨基酸均能反饋抑制植物AHAS 的活性,并且亮氨酸與纈氨酸或異亮氨酸一起具有協同反饋抑制效應[15-16,18,24-26]。而細菌和酵母的AHAS 主要或只受纈氨酸反饋抑制調控[27]。此外,AHAS 酶活性還受輔助因子調控,二磷酸硫胺(ThDP,thiamine diphosphate)和Mg2+是該酶的輔助因子,ThDP 在Mg2+等二價金屬離子協助下結合到AHAS 的活性位點。但與大多數依賴于ThDP 的酶不同,植物AHAS酶還需要黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)作為輔助因子才能行使其催化功能。

由于產物的負反饋機制調控著AHAS 酶活性,因此人們通常難以通過增強BCAAs 合成途徑中的酶基因表達水平提高植物組織中的BCAAs 含量。最近Chen 等通過遺傳篩選獲得擬南芥耐BCAAs 的突變體,并發現VALINE-TOLERANT 1(VAT1)位點的突變使其具有纈氨酸抗性。VAT1編碼AHAS 調節亞基,在幼嫩、快速生長組織高度表達。他們還發現表達突變型vat1基因的轉基因擬南芥顯著增加纈氨酸的耐受性,并積累高水平BCAAs[25]。這一結果顯示通過打破AHAS 調節亞基的產物負反饋機制,人們有望提高作物中的BCAAs 含量。另一有趣發現是,水稻AHAS 催化亞基中某些位點的突變(W548L 或S627I)也能夠減弱產物的負反饋調控效應,并使BCAAs 的積累增加2～3 倍[26]。這些結果表明AHAS的2 個亞基同時參與產物的負反饋調控,有效地削弱這種機制可能成為提高作物中BCAAs 水平的一種手段。

3 植物中AHAS 抑制劑類除草劑的抗性機制

3.1 靶標抗性

在農業上,抗咪唑啉酮類或磺酰脲類除草劑的農作物種質創制取得了較大進展,目前已獲得具有除草劑抗性的玉米、小麥、大麥、水稻、棉花、大豆、油菜、向日葵、甜菜、萵苣、番茄、煙草等作物的種質資源[22,28-38]。在這些作物中,因AHAS 基因突變產生的除草劑抗性具有顯性或半顯性的特點,且常呈單基因遺傳[22]。

現有大量證據顯示,多數情況下作物乃至雜草中AHAS 抑制劑除草劑抗性的形成與AHAS 催化亞基的某些氨基酸殘基改變引起植物對除草劑的敏感性下降或與AHAS 表達量的增加有關,這種抗性屬于典型的AHAS 靶標抗性(TSR,target-site-based resistance)。在很多具有除草劑抗性的植物中,AHAS催化亞基上的Ala122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654 氨基酸殘基(相對于擬南芥AHAS 催化亞基的氨基酸位置)常被其他氨基酸殘基取代。氨基酸殘基Ala122、Pro197 和Ala205 位于酶的氮端,而Asp376、Trp574 和Ser653位于碳端[39]。Ala122、Ala205、Ser653、Gly654 殘基的取代使植物具有很高的咪唑啉酮類抗性[22,40-41],而Pro197 殘基的取代則賦予很高的磺酰脲類抗性,同時還使植物具有較高的三唑并嘧啶類和/或咪唑啉酮類抗性[30,42-47]。取代Trp574 殘基能使AHAS 酶具有很高的咪唑啉酮類、磺酰脲類和三唑并嘧啶類除草劑抗性[29,40,46,48-49],同時對嘧啶硫代苯甲酸類也有抗性。取代Arg377 殘基能使植物同時獲得三唑并嘧啶類、磺酰脲類以及磺酰胺羰基三唑啉酮類除草劑抗性。而取代Asp376 殘基則使植物對所有已知的AHAS 抑制劑產生抗性。這些發現說明,AHAS 催化亞基中的某些氨基酸很可能是多種除草劑的共同結合位點,而某些氨基酸則專一影響特定種類除草劑與AHAS 酶的結合[18,50]。因此,AHAS 的某些氨基酸點突變只對單一或少數十分相似的抑制劑產生抗性,而某些特定氨基酸的點突變則能使此酶具有抗多種除草劑的功能。根據這一特性推測,使用同一類除草劑中的2 個或2 個以上AHAS 抑制劑篩選某一作物誘變群體有可能獲得抗2 種或2 種以上除草劑的突變體,不過,這種假設是否成立尚需實驗驗證。

3.2 非靶標抗性

植物對AHAS 除草劑的抗性并非總是由靶標抗性機制所致,越來越多的研究發現,很多抗這類除草劑的雜草含有非靶標抗性(NTSR,non-target-sitebased resistance)機制[47,51-55]。某些虞美人(Papaver rhoeas)在AHAS 基因沒有發生突變的情況下仍能對甲氧咪草煙產生抗性,另一些虞美人亦因苯磺隆的遷移速率提高或甲氧咪草煙的代謝速率加快而對AHAS 抑制劑產生抗性,這些現象說明在一些虞美人中存在NTSR 機制[47]。Scarabel 等[52]發現虞美人對甲氧咪草煙所產生的NTSR 在連續2 個世代均可遺傳；對磺酰脲類的三氟甲磺隆所產生的NTSR 能在F1代觀察到并且可以遺傳給F2代；對三唑并嘧啶亞類的雙氟磺草胺所產生的NTSR 在F2代出現。這些結果說明虞美人對不同種類除草劑所產生的交互抗性是由多個不同的基因控制,且這種抗性很可能是由多個具有中度抗除草劑效應的未知位點經世代累加逐漸形成的。另外,某些播娘蒿(Descurainia sophiaL.)雜草中也存在NTSR,這是因為細胞色素P450 抑制劑——馬拉硫磷(malathion)能大幅逆轉其對苯磺隆的抗性[53]。相應地,RNA-Seq 分析顯示,該雜草中可能存在多個候選基因參與植物體內除草劑的降解過程。與缺乏除草劑抗性的播娘蒿相比,抗除草劑的播娘蒿含有26 個差異表達基因,其中包括4 個cytochrome P450s、1 個ABC 運輸蛋白和3 個糖基轉移酶相關基因。后續的qRT-PCR 驗證表明與CYP96A13 和ABCC1 運輸蛋白同源的2 個基因在抗除草劑的播娘蒿中過量表達[53]。再者,在耐煙嘧磺隆除草劑的某些馬唐(Digitaria sanguinalisL.)雜草中和對多種AHAS 除草劑(如煙嘧磺隆、五氟磺草胺和雙草醚)具有交互抗性的剪刀草(Sagittaria trifoliaL.)中均不存在靶標基因的突變位點,但馬拉硫酸處理能有效逆轉其對除草劑的抗性；相應地,這些耐除草劑雜草具有較高的除草劑代謝速率。這些結果表明細胞色素P450 參與了某些雜草的NTSR 機制的形成,該機制對雜草除草劑抗性的產生起著重要作用[54-55]。

除了AHAS 抑制劑類除草劑,其他類型除草劑也能誘發雜草產生NTSR。大穗看麥娘(Alopecurus myosuroides,black-grass)雜草能對3 種乙酰輔酶A 羧化酶(ACCase)抑制劑和1 種AHAS 抑制劑產生抗性。試驗顯示,多重抗性的形成可能需要3個以上NTSR位點同時存在。某些NTSR 位點只能賦予植物對某一種特定除草劑產生抗性,而對試驗中的其他除草劑沒有效應[51],這說明不同除草劑可能在植物中誘發產生不同的NTSR 機制。最近報道指出,日本看麥娘(Alopecurus japonicus)雜草中ACCase 抑制劑類除草劑精噁唑禾草靈抗性的形成與細胞色素P450 CYP72A 亞族的3 個成員以及細胞色素P450 家族中的CYP81 表達上調有關[56]。另外,NTSR 也存在于對草甘膦(作用于烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶,EPSPS)、百草枯和烯禾啶以及其他ACCase 抑制劑表現出多重抗性的意大利黑麥草中[57]。此外,某些長芒莧[Amaranthus tuberculatus(var.rudis)]雜草能對多種4-羥苯(基)丙酮酸雙(加)氧酶(HPPD)抑制劑類除草劑(硝磺草酮、環磺酮、苯唑草酮)產生抗性,而細胞色素P450 抑制劑能使該雜草喪失對環磺酮的抗性,這說明該雜草NTSR 形成的一個主要因素與細胞色素P450 酶活性的增強加速了HPPD 抑制劑類除草劑的代謝速率相關[58]。

迄今,NTSR 在農作物中的研究甚少,而且其重要性被嚴重低估[59-60]。研究表明秈稻對AHAS 抑制劑除草劑雙草醚具有耐受性,而粳稻品種則對此敏感。圖位克隆法與互補試驗發現秈稻對雙草醚的耐受性是由1 個新的細胞色素P450 單加氧酶CYP72A31 控制[60]。CYP72A31 轉基因水稻與擬南芥植株對雙草醚的耐受性與該基因的表達量相關,而且CYP72A31 過表達擬南芥植株還對芐嘧磺隆產生耐受性,說明雙草醚與芐嘧磺隆均能在CYP72A31 作用下轉化為低毒化合物[60]。CYP72A31的除草劑專一性不同于另一細胞色素P450 單加氧酶,即CYP81A6,后者只能賦予植物對芐嘧磺隆的耐受性。由此推測CYP72A31 基因是田間雜草防治研究的一個潛在遺傳資源,為一些作物的分子設計育種提供了新的思路[60]。

綜上所述,植物對AHAS 抑制劑類除草劑所產生的抗性分為TSR 與NTSR。TSR 通常由AHAS 催化亞基的某些氨基酸殘基發生改變引起植物對除草劑的敏感性下降或由AHAS 表達量增加所致,而NTSR 則與除草劑的代謝速率、去毒效力以及吸收和運輸速率有關。AHAS 抑制劑與其他類型除草劑在特定條件下均能誘導植物產生NTSR,在很多情況下細胞色素P450 參與這種機制的形成。但由于在單一高等植物個體中存在200 個以上不同基因編碼的細胞色素P450 酶,目前仍無法清晰地回答下述3個問題：(i)究竟哪些特定的細胞色素P450 能夠專一地使植物對特定種類除草劑產生抗性[61]；(ii)與NTSR 相關的基因突變是否位于某一編碼細胞色素P450 的基因的啟動子/5'-UTR/3'-URA 或編碼區上,并最終影響此酶的活性；(iii)與NTSR 相關的基因突變是否位于某個轉錄調控因子上,從而影響多個細胞色素P450 基因的表達。還有,雖然代謝抗性被認為是一種非常重要的NTSR 機制,但是目前人們還不清楚究竟還有哪些基因直接參與NTSR 的形成[62]。此外,最近發現,雖然野燕麥(Avena fatuaL.)對多種除草劑產生的抗性由NTSR 機制所致,但谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferase,GST)與相關酶在野燕麥中的表達量增加并非直接參與提高精噁唑禾草靈或咪唑乙煙酸除草劑的代謝速率[63]。Burns 等認為這些酶活性的提高增強了廣義防御網絡對除草劑的應答反應。雜草長期在半致死劑量除草劑處理下產生的響應,如同植物在很多非生物和生物脅迫下產生的響應,最終導致NTSR 機制的形成。NTSR 與系統獲得性馴化(SAR,systemic acquired acclimation)和系統獲得性抗性(SAA,systemic acquired resistance)具有某些共同特性[63-66]。

4 展望

利用高效除草劑降低雜草危害促進了省工省時的現代簡化農業體系的建立,但是在此基礎上發展高效均衡的多元化作物耕作制度所必需的一個前提是創制獲得對不同類別除草劑具有多種抗性機制的作物新品種。在此情形下,我們可以通過使用不同類別的除草劑,降低單一除草劑的使用對土壤微生物種群的變化造成的負面影響以及前茬作物田殘留除草劑對后茬作物產生的藥害,同時還可降低抗除草劑雜草產生的頻率。目前,抗咪唑啉酮類或磺酰脲類除草劑的農作物種質創制工作進展迅速,但針對其他除草劑的農作物種質創制鮮有報道。相比玉米、小麥、水稻、棉花、大豆、油菜等主要農作物,花生除草劑抗性性狀的遺傳改良研究進展緩慢。在很多花生產區,以麥田套作和夏直播花生為主的栽培模式很普遍,因而麥田除草劑的使用會在一定程度上影響花生的生長,從而降低了利用這種栽培模式提高復種指數與高效利用有限耕地資源所帶來的益處。上述事實表明,創制獲得一系列對不同芽前和芽后除草劑具有抗性的花生和其他農作物種質資源對完善不同作物的輪作種植制度有重要意義。

如前所述,AHAS 中的某些氨基酸殘基與特定抑制劑的結合具有專一性,而另一些氨基酸殘基則是多種除草劑的共有結合域[18,52],因而AHAS 中氨基酸突變位點的差異在很大程度上決定了植物對除草劑抗性的專一性和廣譜性。可以推測AHAS 中某些特定氨基酸的改變有可能允許同一類抑制劑中的不同化合物或結構相近的不同除草劑有效地結合到AHAS 的某些相同位點,若使用由多種AHAS 抑制劑組成的復配劑篩選特定作物的誘變群體,有可能獲得對多種除草劑具有耐受性的新種質資源,開展這種嘗試性的研究有望拓寬作物種質資源庫。

在掌握除草劑抗性與靶標突變位點的對應關系基礎上,當今高效基因編輯技術(如CRISPR/Cas9 等)的發展可為創制多樣化的除草劑抗性性狀的種質資源提供革命性的解決方案[65-69]。Li 等和Svitashev 等試圖將含有能賦予除草劑抗性的突變DNA 模板整合到由CRISPR/Cas9 引起的斷裂DNA 雙鏈(DSB)中,并成功地在大豆和玉米中獲得了源于該突變序列的除草劑抗性性狀[65-66]。不過,因在DSB 修復過程中通常難以提供足夠的DNA 模板,而使其在植物基因組編輯中的應用受到了限制。值得注意的是,一種融合了胞苷脫氨酶(BE3)的新型Cas9 在無供體DNA 模板的情況下實現了精準的單核苷酸替換,使得植物基因組的堿基編輯變得更加可行[67],現已運用該基因編輯技術獲得了抗除草劑的水稻和擬南芥[68-69]。目前,Li 等使用RNA 作為同源重組修復的模板,并分別利用核酶自切割和具有RNA/DNA雙重切割能力的基因編輯系統,獲得后代無轉基因成分的抗AHAS 抑制劑類除草劑水稻植株[70]。該工作開辟了利用植物RNA 作為同源供體模板進行同源修復的新方向,是植物基因組編輯領域的重大進展?？梢灶A見,農作物的除草劑靶標抗性的創制將會變得更加容易。相反,因為目前對NTSR 機制知之甚少,尚不清楚究竟由哪些基因參與NTSR 的形成,所以無法充分利用當代高效基因編輯技術創制具有NTSR 性狀的種質資源。NTSR 抗性機制在植物除草劑抗性性狀形成中占有重要地位,它還能與一種新的抗性機制——穩態耐性(meostatic tolerance)協同參與植物除草劑抗性的形成[71],所以將來一個重要研究方向是剖析植物中NTSR 形成的生化與分子機制,以便結合高效基因編輯技術快速培育具有非靶標抗性性狀的作物新品種。

值得指出的是,某些特定AHAS 除草劑抗性性狀除在田間雜草防治中起重要作用外,還具有其他應用價值。其一,除草劑靶酶AHAS 在支鏈氨基酸合成過程中起重要作用,某些氨基酸位點的突變能夠降低或消除產物對AHAS 的負反饋抑制,這種機制的產生會在一定程度上加強植物中支鏈氨基酸的生物合成,因此該類除草劑抗性性狀的開發可在一定程度上為將來研發富含這類人體必需氨基酸的特色作物新品種提供某種基礎。不過需要注意,目前尚不清楚AHAS 特性的改變是否也會對脂類、糖類以及其他物質的合成造成某些影響,所以我們必須合理地評估特定作物中AHAS 抑制劑除草劑抗性性狀的利用價值。其二,某些AHAS 除草劑抗性性狀可應用于化學殺雄。葉面噴施低劑量的苯磺隆可以選擇性地誘導雄性不育,目前這種方法在油菜雜交種的生產上已得到了有效應用[72]。