谷物及其制品中真菌毒素的前處理及檢測技術研究進展

侯廣月，杜營，楊帆，周莉莉，許士明，鄒惠玲

（山東省產品質量檢驗研究院，國家加工食品質量監督檢驗中心＜山東＞，山東濟南 250102）

真菌毒素是產毒真菌在適宜條件下產生的小分子有毒次級代謝物，目前已發現300多種[1]。據報道，全球每年約有25%的農產品被真菌毒素污染，造成數百億美元的損失[2]。真菌毒素污染不僅發生在農作物種植期間，在其收獲、貯存、運輸等環節也會發生[3]。被污染的谷物及其制品通過食物鏈傳遞，對人、畜的肝臟、腎臟、造血系統、生殖系統及神經系統等造成損害，部分真菌毒素還存在致癌、致畸、致細胞突變的重大危害[4]。因此，真菌毒素被世界衛生組織（WHO）和聯合國糧食與農業組織（FAO）列為食源性疾病的三大根源之一[5-6]。真菌毒素的強毒性和高污染頻率，已經成為國際社會重點關注研究的食品安全問題之一。現行國家標準GB 2761-2017《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》對谷物及其制品中黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）和玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）的最大允許含量水平進行了規定[7]。

目前，谷物及其制品中真菌毒素的分析主要包括樣品前處理和儀器檢測兩個環節。樣品前處理常用的方法有液液萃取技術（Liquid-liquid extraction，LLE）、固相萃取技術（Solid phase extraction，SPE）、QuEChERS技術、凝膠滲透色譜技術（Gel permeation chromatography，GPC）、免疫親和層析技術（Immunoaffinity chromatography，IAC）和免疫磁珠技術（Immunomagnetic microbeads，IMBs）。儀器檢測方法主要包括薄層色譜法（Thin layer chromatography，TLC）、酶聯免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、氣相色譜-串聯質譜法（Gas chromatography tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）、液相色譜法（Liquid chromatography，LC）和液相色譜-質譜聯用法（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）。本文對真菌毒素殘留的前處理和檢測方法進行了回顧，以期更好地為谷物及其制品中真菌毒素的研究提供理論指導。

1 谷物及其制品的前處理方法

樣品前處理技術是獲得準確、可靠檢測結果的前提和保障，前處理過程包括樣品制備、提取、分離純化和濃縮等步驟，以最大程度地從復雜基質中提取待測組分為目的[8-10]。

1.1 LLE技術

LLE技術利用液體混合物中各組分在兩相溶劑中溶解度的差異實現凈化提取[11-12]。根據相似相溶原理，乙腈/水或甲醇/水體系是常見的真菌毒素的提取溶劑[13]。LLE技術具有簡單快速、易于實現、操作快速等特點，但存在有機溶劑用量大、不能滿足高通量檢測需求、目標物易流失等問題[11,14]。Soleimany等[15]利用乙腈-水-乙酸對稻米、小麥、燕麥、大麥和玉米粉進行提取，經LLE凈化后，同時測定黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）、OTA、ZEN、DON、伏馬毒素（FB1和FB2）、T-2毒素和HT-2毒素，方法學驗證結果良好。Slobodchikova等[16]以乙酸乙酯為LLE試劑對雪腐鐮刀菌烯醇、DON、AFB1等17種真菌毒素進行凈化處理，既避免使用免疫親和柱，也大大降低了基質效應的影響。楊琳等[17]對糧谷類食品中的黃曲霉毒素和赭曲霉毒素用甲醇-水提取后，以LLE方式凈化后，采用高效液相色譜法同時檢測黃曲霉毒素和赭曲霉毒素，方法簡便快速、凈化效果好，結果表明各項技術指標均符合國家標準的要求。

1.2 SPE技術

SPE技術基于液相-固相色譜分離原理，首先目標物被吸附到合適的固體吸附劑上，通過淋洗使目標物與干擾組分分離，再以合適的洗脫劑將目標物從固體吸附劑上解離出來，從而達到凈化與富集目標物的目的[9-10]。SPE技術具有操作簡單、有機試劑用量少、適用于多殘留分析等特點，目前用于真菌毒素的SPE方法主要采用反相固相萃取柱[18-20]和毒素專用固相萃取柱[21-22]。多功能凈化柱（Multifunctional purification column，MFC）是一種特殊的SPE小柱，它是以極性、非極性及離子交換等幾類基團組成的復合吸附填料小柱。研究表明，MFC凈化過程簡便快速，凈化效果較好，適用于谷物及其制品中多種真菌毒素的測定[23-24]。此外，新型的分散固相萃取技術（Dispersive solid phase extraction，DSPE）也被應用于大米中多種真菌毒素的凈化[25]。

1.3 QuEChERS技術

基于固相分散萃取原理建立的QuEChERS技術是一種具有快速、簡單、便宜、有效、可靠、安全等特征的前處理方法，被廣泛應用于多農藥殘留[26-27]、多獸藥殘留[28-29]、多真菌毒素[30-36]的檢測中。QuEChERS方法的建立與優化主要從提取溶劑、鹽析劑和凈化劑幾個方面來進行。目前，乙腈被廣泛應用于多種真菌毒素的提取，而提取酸堿度、極性范圍敏感的真菌毒素時，需要加入輔助試劑，如乙酸、甲酸、甲醇等以增強提取效果[37-39]。Zhang等[38]建立了一種基于QuEChERS前處理技術同時測定谷物中多種真菌毒素的高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法，結果表明所建立的方法快速、可靠、簡便、靈敏，適用于谷物中多毒素的同時測定。Sospedra等[39]采用改良的QuEChERS技術對小麥粉中多種毒素進行凈化處理，結果表明該方法具有較好的回收率，能滿足小麥粉中多種真菌毒素的檢測。QuEChERS前處理方法需要使用吸附劑，在降低基質干擾的同時，也存在吸附目標物進而使回收率降低的可能性。此外，經QuEChERS技術提取后，提取液中可能會存在共萃取雜質對光學檢測器靈敏度產生影響，進而影響結果的準確性。

1.4 GPC技術

GPC技術基于物質分子量大小，利用體積排阻機理，使分子質量不同的目標分析物被具有分子篩性質的固定相分離。樣品中脂肪、色素等大分子雜質被淋洗出來，在一定程度上降低了大分子基質的干擾[40-41]。劉家陽等[42]將全自動凝膠滲透色譜儀應用于玉米粉中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮等10種真菌毒素的凈化過程中，經驗證該方法具有較好的準確性和重現性，適用于玉米粉中多種真菌毒素的快速測定。宮小明等[43]以GPC技術對花生、糧油產品進行凈化處理后，利用同位素稀釋法對樣品中18種真菌毒素同時測定。研究表明，所建立的檢測技術適用于多組分真菌毒素低含量的定性確證和定量檢測，滿足國際上對真菌毒素檢測的限量要求。

1.5 IAC技術

IAC技術是基于抗原抗體特異性可逆結合的原理對樣品進行凈化，真菌毒素IAC是一種利用免疫反應的高度特異性，以抗原或抗體的一方作為配基親和吸附另一方，從而使樣品得以凈化的分離體系[9,44]。Lattanzio等[45]利用多毒素免疫親和柱對玉米中黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、伏馬毒素等11種真菌毒素進行凈化后，以液相色譜-串聯質譜法對11種真菌毒素進行檢測和定量分析，結果顯示所測定的11種毒素的濃度均接近或低于歐盟最高允許或建議限量值，方法具有較好的適用性。由于大多數真菌毒素是弱免疫物質且相對分子質量小于1 000，目前商品化的IAC種類有限[46-49]；此外，IAC凈化柱價格相對偏高，導致實際應用中具有一定的局限性[9,44]。

1.6 IMBs技術

IMBs技術將生物識別元件（如抗體）和磁性材料（如Fe3O4）偶聯結合成定向固定化免疫磁珠，利用磁場作用特異性地實現樣品凈化、富集的目的[50]。近年來，IMBs技術因具有簡單快速、特異性強的特點，被成功應用于水樣、食品、中藥材中真菌毒素的凈化[51-55]。雷方等[56]通過優化免疫磁珠定向偶聯法制備出可同時凈化小麥中玉米赤霉烯酮、T-2毒素等8種真菌毒素的免疫磁珠，所開發的免疫磁珠親和純化-液相色譜串聯質譜法適用于小麥中多種真菌毒素的同時檢測。由于目前商業化生產優質的免疫磁珠主要靠國外進口，價格昂貴，這在很大程度上限制了IMBs技術的應用。

2 谷物及其制品中真菌毒素的檢測

目前，谷物及其制品中真菌毒素檢測技術主要有快速檢測和確證檢測兩種方法。兩類檢測方法在現場快速篩查和試驗室仲裁檢測形成互補，為防范真菌毒素安全風險提供一定的技術支撐[10,57]。

2.1 TLC法

TLC法是較早應用于真菌毒素檢測的色譜技術[11]，也是很多實驗室檢測真菌毒素的常規手段。Hadiani MR等[58]采用TLC法分離鑒定玉米中玉米赤霉烯酮，方法檢出限可達到100 ng/g，且分離效果良好。由于TLC技術存在試劑消耗量大、前處理過程繁瑣、重現性和靈敏度不高等問題，不能滿足現代食品檢測高靈敏度、高準確度、高自動化的要求。目前TLC方法與其他分離技術聯用逐漸成為一種趨勢，從而建立起一種更有利于定性分析和定量檢測的手段[59-60]。

2.2 ELISA法

ELISA是一種特異性強、靈敏度高、成本相對較低的分析方法，而ELISA法是真菌毒素檢測中常用的一種免疫分析方法[61]。Kadota等[62]建立了一種基于表面等離子體共振的免疫分析方法，用于檢測小麥中血腐鐮刀菌醇和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的含量，結果表明該方法測得的結果與液質測定結果一致。在實際檢測過程中，有學者提出，ELISA法可能出現假陽性結果，不能進行定量分析，常被作為初步篩選手段用于現場檢測篩查[63-65]。

2.3 GC-MS/MS法

GC及GC-MS/MS技術適用于分析熱穩定、易揮發的化合物，而多數真菌毒素穩定性好且不易揮發，因此該方法有一定的局限性，主要適用于單端孢霉烯族化合物的檢測[64,66]。Rodríguez-Carrasco等[67]利用改良的QuEChERS方法對小麥粗粉進行前處理后，首次將氣相色譜-三重四級桿質譜儀應用于展青霉素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素等10種毒素的測定中。結果表明，他所建立的GC-MS/MS方法適用于小麥粗粉中多毒素的檢測，方法的定量限低于10 μg/kg，應用于實際樣品的結果表明，方法的可檢測濃度低于真菌毒素所允許的最大水平，滿足分析要求。

2.4 LC法

LC法具有高分離性能、高靈敏度、不易受基質干擾等特點，結合紫外檢測器、熒光檢測器或蒸發光檢測器可應用于真菌毒素的檢測。謝剛等[68]采用全自動免疫親和在線凈化技術對玉米、小麥中赭曲霉毒素A進行前處理后，以液相色譜法進行測定，所建立的方法滿足谷物中赭曲霉毒素A的快速定量檢測。Bascarán等[69]經免疫親和萃取牛奶中赭曲霉毒素A后，利用液相色譜-熒光檢測法對赭曲霉毒素A含量進行測定。Wang等[70]在無衍生化處理的情況下，利用液相色譜-蒸發光散射法對玉米中伏馬毒素B1、B2、B3、B4進行測定，方法檢測限達3 mg/kg。目前，LC技術主要用于單一化合物或同一類型的真菌毒素的檢測，在多類型真菌毒素同時檢測時具有一定的局限性。

2.5 LC-MS法

LC-MS技術將液相色譜與質譜結合起來使用，既具有液相色譜儀的靈敏度高、分離性能高等特點，也具有質譜儀很強的結構解析及組分鑒定能力，實現了色譜高分離能力和質譜強鑒定性能的優勢互補，使LC-MS技術成為一種靈敏、高效、快速的檢測手段。目前，液質聯用技術被廣泛用于多目標毒素及代謝物的檢測[71-76]。鑒于LC-MS的特點，該技術已成為食品中多目標毒素及代謝物檢測的定性確證和定量分析的重要手段。Zachariasova等[36]利用液相色譜-高分辨質譜聯用技術分析了谷物中多種鐮刀菌毒素，同位素內標和基質配標均被用于定量分析中，采用飛行時間質譜和Orbitrap兩種高分辨質譜技術應用于谷物中11種鐮刀菌毒素的測定。高敬銘等[48]采用復合免疫親和柱對糧食中的6種真菌毒素進行凈化后以液相色譜質譜聯用技術進行同時檢測，方法定量準確、快速、靈敏度高，適用于大米、小麥等糧食中多種真菌毒素的定性定量檢測。劉拉平等[71]采用SPE凈化結合溶劑萃取技術，利用液相色譜-串聯質譜法在電噴霧負離子模式下對糧食中的ZEN和DON兩種毒素同時測定，實現了糧食產品中ZEN和DON毒素的同步快速分析。

3 小結

真菌毒素是產毒真菌在適宜條件下產生的小分子有毒次級代謝物，其強毒性和高污染頻率成為影響谷物及其制品產業發展的重要原因。因此，建立高效的樣品前處理方法及快速準確、高通量的多目標毒素檢測手段成為谷物及其制品中真菌毒素定性確證和定量分析的研究重點，也為切實保障“舌尖上的安全”提供一定的技術支持。