番茄花粉敗育型雄性不育研究進展

暴會會，王少坤，尹竹君，馬瑞紅，謝俊俊，張 杰，楊正安*

(1.云南農業大學 園林園藝學院，云南 昆明 650201；2.玉溪市澄江縣經濟作物工作站，云南 玉溪 652599)

番茄(LycopersiconesculentumMill.)屬茄科(Solanoideae)番茄屬(Lycopersicon)自花授粉的一種蔬菜作物。2018年10月發表于《Nature》的文章，李停棟[1]和Agustin Zsogon等[2]利用基因編輯技術CRISPR-Cas9，靶向番茄產量、生產力、營養品質相關的基因成功馴化野生番茄，同時后代保持親本的優良特性，加速了育種進程?？梢?，番茄改良育種及相關研究在中國乃至世界得到持續關注。但目前番茄雜交制種仍以人工去雄為主，費時費力、制種成本高且雜交種純度低。一直以來花粉不育型和雄蕊退化型保持較困難，功能不育型受環境影響較大，不易達到100%不育度，致使這些不育類型極少在生產上應用[3]。目前，隨著科學家對擬南芥和水稻的花藥和花粉發育的分子調控機制研究的不斷深入[4]，通過人工創制番茄花粉敗育型雄性不育突變體已成為可能。盡管花藥發育機理已在擬南芥和水稻中開展了大量的研究工作，但有關番茄花藥和花粉發育調控相關機理的深入研究卻報道較少。因此，要想獲得具有應用價值的番茄不育材料，必須加強對番茄雄性不育調控機制的研究。

1 番茄雄性不育概述

植物雄性不育在植物界存在普遍，雄性不育的植株雄蕊發育不正常。利用雄性不育可以免去人工去雄這一步驟，簡化制種程序，降低種子成本，提高種子純度。番茄雄性不育分為以下4種類型：部位不育(L型不育)、功能不育(J型不育)、雄蕊退化型、花粉敗育型。其中，花粉敗育型的主要表現為空癟花粉、不能形成正常的四分體。番茄花粉敗育主要發生在減數第二次有絲分裂后期至四分體形成之際(約42%)和小孢子發育早期至大液泡形成之前(約52%)。敗育的直接原因有：部分絨氈層細胞的提早溶解、不同時溶解或溶解不徹底造成減數分裂后小孢子營養不足，從而導致發育異常。國內外學者從細胞學、生理生化、分子機制等多方面對番茄進行了深入研究。番茄雄性不育受多種因素影響，從而可以通過多種途徑創造雄性不育突變體。例如，改變內源激素平衡[5-6]、調節物質能量代謝[7]、化學誘導[8]、分子標記技術[9]等。在遺傳育種方面，基因工程技術彌補了常規雜交育種的不足，可以根據所需條件，有目的且有效地篩選目標性狀選育新品種，創制新的植物種質資源。利用基因工程技術可以提高番茄產量、改良品質、增強抗性[10]。在番茄應用上可以利用基因工程技術創制雄性不育突變體，對花粉敗育相關基因進行精確編輯，加速我國番茄雄性不育發展進程。

2 影響番茄花粉敗育的因素

2.1 環境

番茄雄性不育的表達易受環境調控，育性轉換有時量變，有時質變，這種轉換方式為人工生理調控育性創造了條件。育性基因型品種即使正常條件下也不是可育的，如遇到高溫干旱、冷害、缺素、光照不足等均可能引起生理性不育。光周期對小孢子不同時期也有不同影響[11]。Peet等[12]認為，高溫可使花粉減少，并且隨著高溫時間的延長，花粉減少的數量也隨之增加，不育性增加，尤其是夜溫對不育影響更大。Santokh等[13]認為，低溫可使sl-2育性恢復。總之，溫度對雄性不育的影響主要由于花粉等發育相關代謝化合物的改變而引起的。Fellner等[14]發現，番茄花粉敗育突變體受光周期調節，長日照條件(16 h/8 h)表現雄蕊皺縮，無法產生可見花粉；短日照條件(8 h/16 h)可產生正?；ǚ?。

2.2 激素

在前人對無雄蕊番茄的研究中，有研究表明生長素的積累與花粉敗育有關[15-16]。在雄性不育突變體番茄sl-2的花和葉片中，內源GA含量低于正常可育株[6]。使用CCC處理可抑制番茄離體培養花芽雄蕊正常發育[17]。高含量的IAA和低含量的GA是引起sl-2雄性不育的因素之一，可能與生長素誘導乙烯產生有關[18]。絨氈層延遲退化或者提前解體可導致花粉敗育，IAA在調節養分競爭方面起了重要作用。因此，在花藥中尤其是在絨氈層中，IAA的積累或者缺少與絨氈層解體時間的相關性需要進一步研究[6]。另外，番茄不育類型ABA濃度較高，在雄蕊中表現的尤其明顯。其中，ABA含量受溫度影響，低溫條件ABA含量相對降低，與低溫試sl-2育性恢復相關[13]。

總之，通過環境的改變可以導致番茄雄性不育，但這種不育往往是不確定的，難以應用于商業化生產。只有進一步研究是什么導致番茄的雄性不育，對其進行精確的分子機制解析，才能更好地將番茄雄性不育應用于生產之中。

3 番茄花粉敗育型雄性不育的分子機制

3.1 花藥絨氈層發育相關基因研究進展

高等植物花發育是植物發育的中心環節，是植物個體由營養生長向生殖生長轉變的結果和植物繁殖的基礎[19]?；ǚ郾谧鳛橹参锛毎囊环N防御結構，在花粉發育和受精過程中起著重要的作用?；ǚ郾诘陌l育經歷初生外壁形成、外壁形成、內壁形成，與花藥中一個重要結構——絨氈層發育密切相關[20]?；ㄋ幈诩毎凶顑鹊囊粚訛榻q氈層細胞，與小孢子母細胞及花藥發育后期的小孢子直接相互作用，在花粉發育過程中至關重要。同時，絨氈層還能分泌一些物質，參與植物授粉過程中花粉和柱頭間的識別[21]。絨氈層發育任一過程受阻都會導致雄性不育?；ㄋ幗q氈層細胞需要經過一個細胞程序性死亡的降解過程，為小孢子的發育提供營養和物質保證，番茄的絨氈層細胞屬于變形絨氈層類型，在四分體時期溶解，形成周原質團，提前或延遲降解都會導致番茄雄性不育[22]。

植物花粉外壁外層由孢粉素組成，孢粉素在花藥發育四分體時期組成，擬南芥中已報道了8個孢粉素合成基因[23-29]。在孢粉素前體合成過程中，線粒體釋放出的乙酰輔酶A作為質粒脂肪酸合成(FAS)的底物。C12、C16、C18脂肪酸合成后，用Acyl-CoA合成酶5(ACOS5)修飾后轉移至內質網(ER)，經過CYP703A和CYP704B的羥基化后，再用ACOS5對產物進行輔酶A-酯化。最后通過下游的MS2和LAP5/6將產物轉化為孢粉素前體[30-33]。透射電子顯微鏡下的免疫化學定位顯示ACOS5、PKSA/B、TKPR1/2定位于絨氈層細胞[34]。Xiong等研究認為CYP703A2-GFP定位于絨氈層和花藥室中[35]。另外，楊仲南等利用GFP融合基因轉基因植株，發現了孢粉素合成基因在絨氈層細胞表達，結果表明，所有孢粉質生物合成蛋白質在絨氈層中特異性表達并分泌到花藥室中[36]。

絨氈層發育特征性決定基因首先在擬南芥中被分離和報道，SPOROCYTELESS(SPL)/NOZZLE(NZZ)基因的突變，導致絨氈層、花粉囊、孢子母細胞原基發育受阻，不能形成花粉囊[37]。花藥細胞分化早期調控絨氈層發育的基因有AG、SPL/NZZ、TPD1、EMS/EXS、MPK3/MPK6、BAM1/BAM2、ER/ERL1/ERL2等[38-40]。TDF1(TAPETAL DEVELOPMENT AND FUNCTION 1)、AMS(ABORTED MICROSPORES)、MYB103、MS1(MALE STERILITY1)是調控絨氈層后期發育的4個主要轉錄因子。DYT1是絨氈層開發中最上游的調節劑。DYT1通過直接調節TDF1影響與絨氈層發育和花粉壁形成相關的許多下游基因[41]。TDF1直接調節AMS，AMS調節MS188，MS188調節MS1[42-43]。因此，這些轉錄因子在控制絨氈層發育中形成遺傳途徑(DYT1-TDF1-AMS-MS188-MS1)。MALE STERILITY188(MS188)及其直接上游調節因子ABORTED MICROSPORES(AMS)是對于絨氈層發育必不可少的2種轉錄因子。MS188是在絨氈層中表達的MYB轉錄因子，其直接調節多克隆合成酶A(PKSA)、PKSB、MALE STERILE2(MS2)和CYTOCHROME P450基因(CYP703A2)的表達。在遺傳途徑中，AMS可以在體內與CYP703A2、PKSB、TKPR1和CYP704B1的啟動子結合[44]。AMS突變體顯示異常增大的絨氈層細胞和敗育的小孢子[45-46]。

3.2 bHLH轉錄因子與植物花粉敗育型雄性不育

堿性-螺旋-環-螺旋(basic-helix-loop-helix,bHLH)轉錄因子家族在動植物中廣泛存在。其結構域大概由60個氨基酸組成，包括堿性(Basic)區域和螺旋環螺旋(HLH)區域，堿性區域位于bHLH結構域N端，主要與DNA結合有關；HLH區域分布在bHLH的C端，主要由疏水氨基酸殘基構成，利于HLH之間相互作用形成二聚體[47-48]。bHLH轉錄因子堿性區域的某些氨基酸能夠與基因啟動子區域的E-box(5′-CANNTG-3′)結合，從而調控靶基因的表達[49-50]。

目前，已報道的與花粉形成相關的bHLH轉錄因子大部分參與小孢子或者花藥絨氈層的發育過程。已有研究結果表明，bHLH轉錄因子的功能異常引起的不育植株在敗育特征上具有相似性，即表現出絨氈層細胞提前或延遲降解，導致花粉形成受阻敗育。已經鑒定出來的參與小孢子發育的bHLH轉錄因子集中在模式植物擬南芥(AMS、DYT1)[51-53]、玉米[54](MS32)、水稻[55-58](TDR1、EAT1、bHLH142等)等植物中。在擬南芥中，bHLH家族成員GLABROUS3(GL3)和TRANSPARENT TESTA8與MYB家族成員TRANSPARENT TESTA2、GL1和MYB61相互作用以調節二氫葉綠酸還原酶和LEUCOANTHOCYANIDIN氧化酶在花青素合成中的表達[59-60]。GL3-GL1復合物也是根表皮和毛狀體發育所必需的[61-62]。bHLH-MYB復合物調節茉莉酮酸介導的雄蕊和種子成熟[63]。bHLH家族成員MYC2與MYB2相互作用以調節脫落酸誘導途徑的基因表達[64-65]。在花藥發育期間，其他3個bHLH家族成員(bHLH010、bHLH089和bHLH091)也參與絨氈層發育和雄性可育[66-67]。酵母雙雜交測定顯示MS188也與AMS和bHLH010相互作用。因此，MS188或其他MYB可與AMS或其他bHLH形成不同的組合以調節相對孢粉質合成基因的表達。MS188和其他MYB在激活CYP704B1、ACOS5、TKPR1和TKPR2的表達中起著冗余作用。其中，AMS對于TKPR1的表達至關重要，因為它不能通過MS188在AMS突變體中恢復。AMS和其他bHLH也可參與激活CYP704B1、ACOS5和TKPR2的表達。MS188對于激活CYP703A2、PKSB、PKSA和MS2的表達是必需的。由于MS188在AMS突變體中部分恢復CYP703A2和MS2的表達，因此AMS是重要的，并且其他bHLH在調節它們的表達中發揮部分冗余作用。對花粉發育相關bHLH蛋白進行同源性分析發現，不同物種間參與小孢子發育bHLH轉錄因子具有高度同源性。因此，分析比較這些bHLH轉錄因子結構特點與功能特征，對于挖掘番茄等其他植物參與花粉形成的bHLH轉錄因子的功能具有重要意義。

3.3 AMS基因與花粉敗育型雄性不育的關系

AMS為敗育小孢子基因，首先發現于擬南芥，是影響花藥絨氈層和小孢子發育的關鍵基因，調控花藥細胞分化的一個關鍵調控因子[68]。

花藥發育過程中，AMS是花粉壁合成的關鍵因子，bHLH類轉錄因子，對AMS基因突變體進行形態學分析，其突變體能夠形成絨氈層，導致絨氈層和中層細胞在小孢子母細胞減數分裂時期擴大化，正常的程序性死亡(PCD)過程受阻，阻礙小孢子母細胞的正常發育，不能正常形成花粉外壁，最終導致花粉敗育，進而導致雄性不育[69]。番茄是較易進行基因工程操作的重要蔬菜作物，基因組較小，是一種理想的模式植物，是最早開展基因轉化研究的高等植物之一[70-71]。

許杰等從形態學、分子生物學、遺傳學以及宏觀調控網絡等不同層次對AMS的功能進行深入分析，結果表明，AMS是花藥發育的一個關鍵承上啟下調控因子，是絨氈層細胞的程序性死亡和花粉外壁發育所必需的，是絨氈層發育調控網絡中的重要組成部分，其研究結果對于闡明植物花藥發育和花粉形成的分子機制具有重要意義。植物花藥花粉發育的分子生物學及雄性不育機理的研究，使雄性不育基因工程得以實現。中山大學張宏將花粉絨氈層細胞特異表達的啟動子TA29與核糖核酸酶基因構建成嵌合基因轉入番茄子葉獲得了具有番茄雄性不育特征的轉基因番茄。通過基因共表達(co-expression)分析和調控網絡(network)的構建等生物信息學工具，在全基因組水平上尋找AMS直接調控的基因，及AMS在絨氈層的細胞性程序死亡過程和花粉外壁形成的調控機理，同樣表明AMS在脂類肽鏈的合成、修飾、運輸及小孢子外壁蛋白合成等各個方面，來完成對花粉外壁發育的調控。Sheng等快速定位和鑒定了甜瓜中的ms-5基因，AMS基因被鑒定為雄性不育候選基因[72]。楊仲南等利用SRDX顯性抑制試驗揭示了MYB家族轉錄因子MS188可能與同家族的轉錄因子一起調控孢粉素合成基因表達，結果表明，在絨氈層中，AMS直接調控MS188表達并與之相互作用，AMS也能結合在孢粉素合成基因啟動子上。AMS與MS188形成正饋回路調控孢粉素的快速合成[36]。Shen等發現CaAMS優先在四分體和早期-中期單核階段的絨氈層中表達。CaAMS的下調導致辣椒花部分花絲縮短、萎縮、不裂的雄蕊和敗育的花粉。參與花粉外壁形成的幾個基因在CaAMS-沉默的花藥中被下調。這些結果表明CaAMS通過調節復雜的遺傳網絡在辣椒絨氈層和花粉發育中起重要作用[73]。

所以，通過AMS基因創造番茄雄性不育，基因工程雄性不育番茄的獲得植物花粉花藥發育的分子生物學及雄性不育機理的深入研究，使雄性不育基因工程成為現實。

4 物質能量代謝與番茄雄性不育

在番茄雄性不育突變體中，不育雄蕊中可溶性蛋白含量降低，合成緩慢而且伴有特異蛋白的降解。蛋白質總含量和可溶性蛋白含量均低于可育花粉。淀粉物質積累是許多植物花粉的特征。脯氨酸是花粉中氨基酸的一種儲藏形式，可轉變為谷氨酸等其他氨基酸，脯氨酸在花粉中與碳水化合物互相配合，提供營養來促進花粉發芽、花粉管伸長。富含游離脯氨酸是正?；ǚ鄣囊粋€重要特征。在番茄不育花藥中，脯氨酸含量下降，對不育花粉外源施加脯氨酸也不能恢復育性。Smith等[74]通過差異性篩選在絨氈層中克隆了一個基因108，只有在減數分裂的晚期才開始表達，表達峰值出現在花芽長8～9 mm時。為基因的表達可能與絨氈層的物質代謝、花粉外壁蛋白沉積及營養供給有關研究提供了證據。另外，王柏珂等[75]以番茄雄性不育系材料，通過同源克隆方法，克隆4個雄性不育候選基因，其中有3個候選基因在雄性不育系與可育系之間發生了突變。通過生物信息學分析發現的第一個基因Solycg001是一個剪切體蛋白基因;第二個基因Solycg002是一個淀粉與蔗糖代謝通路中的酶;第三個基因Solycg003是一個核糖體基因。根據前人的研究,確定了植物的雄性不育是由于淀粉及可溶性糖的代謝異常引起的,初步判斷第二個基因Solycg002(序列全長為2473 bp，3個位點發生單位點突變,分別是1194處C替換為A、1211處A替換為G、1529處T替換為C)為不育目標基因，該基因突變可導致淀粉及其他可溶性糖的代謝紊亂。在Xu等的研究中，觀察到AMS能夠通過直接結合PKSB、TKPR1、CYP98A8和CYP98A9的啟動子而觸發孢粉質前體，羥基化α-吡喃酮和酚類化合物的形成；擬南芥CYP98A8和CYP98A9顯示在絨氈層細胞中表達并且是氧化苯酚酰胺形成所需的；PKSB/LAP5和TKPR1/DRL1編碼產生羥基化α-吡喃酮聚酮化合物的酶，其被認為是孢粉質單體；PKSA和PKSB編碼植物型III聚酮化合物合酶，其催化丙二酰輔酶A和β-羥基化脂肪?；o酶A縮合以產生三-和四-酮基α-吡喃酮化合物。PKSA和PKSB特異性地在絨氈層細胞中瞬時表達，并且PKSA和PKSB突變體缺乏明顯的外壁，導致完全的雄性不育。新出現的證據表明，花粉涂層EXL與GRP結合在授粉的最初步驟中發揮作用，即對柱頭的水合作用。另外，還發現AMS直接調節花粉外殼蛋白EXL和GRP的表達，這些蛋白涉及花粉外壁和花粉層形成以及隨后的授粉。簡而言之，這些數據支持AMS在花粉發育過程中的多樣化和關鍵作用，其中包括在小孢子母細胞分離中的直接轉錄調節作用，四分體愈傷組織的溶解，以及隨后在生物合成和花粉層形成中的孢粉[76]。

5 結語與展望

從現有的研究來看，花粉敗育是一個極其復雜的發育過程。隨著生命科學技術快速發展，科學家們對番茄雄性不育的研究已經從形態學、細胞學、生物化學逐漸轉向分子生物學領域。目前利用形態學標記、分子學標記，將各種不同類型的番茄雄性不育基因定位到各條染色體上。參考已測序番茄品種全基因組序列確定區間候選基因，對候選基因進行克隆，挖掘突變位點并通過生物信息學分析候選基因的功能機理，篩選不育目標基因，為番茄雄性不育的研究及應用提供理論依據。本課題組也在研究番茄花粉不育相關基因，通過對目標基因克隆及序列分析、轉化等工作，進一步解析番茄花粉花藥調控機制。相信隨著雄性不育研究的不斷深入，必將推動我國番茄花粉敗育型雄性不育研究發展。