沙門氏菌檢測的研究進展

郭耀東，韓曉江，張英華，岳田利

（1.商洛學院健康管理學院，陜西商洛 726000；2.商洛市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，陜西商洛 726000；3.西北大學食品科學與工程學院，陜西西安 710069）

沙門氏菌最早在1885年被發(fā)現(xiàn)，在自然界中分布較為廣泛，可引起動物和人體患有疾病，具有傳播性。每年超過3 000萬人感染沙門氏菌，引起死亡20多萬人。作為革蘭氏陰性菌的一種，菌群種類較多，在豬肉、雞肉、海產(chǎn)品等食物中都可受到沙門氏菌的污染，如果被人攝食，進而導致人體疾病的發(fā)生。近10年間，由沙門氏菌引發(fā)的中毒事件達到166起，累計發(fā)病近9 000人，主要由腸炎沙門氏菌菌群所引起，而沙門氏菌中毒事件主要發(fā)生在夏秋季節(jié)，天氣炎熱，菌群生長繁殖較快，更多由交叉污染或者加工不當引起。因此，能夠快速檢測食品中的沙門氏菌對人類公共安全和食品安全都具有重要意義。

1 檢測方法

目前，利用國標法檢測食品中沙門氏菌是標準檢測方法，但操作復雜、耗時太久，影響事件結(jié)果，隨著科技的發(fā)展和分子生物學的興起，各種先進技術用于沙門氏菌的檢測。

1.1 PCR技術檢測

武曉松等人[1]對蔬菜中沙門氏菌建立了一種快速檢測的PCR方法。其根據(jù)特異基因設計引物并對其進行PCR擴增，根據(jù)沙門氏菌不同濃度菌懸液產(chǎn)物與平板菌落數(shù)的對應線性關系確定沙門氏菌的檢出限。研究發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌穩(wěn)定特異性基因為invA基因，對沙門氏菌檢出限為1 550 CFU/mL，對香菜的檢出限為63 CFU/g。研究建立的沙門氏菌PCR檢測方法可用于檢測蔬菜中沙門氏菌的污染狀況。Erik E等人[2]利用PCR技術檢測糞便中的沙門氏菌，總共測試了391個樣本，該方法的靈敏度為0.88，并且在100個非種子樣品中沒有獲得假陽性結(jié)果。在PCR分析之前沒有進行DNA提取，方法非常簡單。總體結(jié)果清楚地表明，包括所有動物物種和所有血清型的糞便，MSR表現(xiàn)最佳，其中一個計算精度為99%，計算靈敏度為98%。該方法與各種商業(yè)ELISA方法和NMKL方法比較，檢測的靈敏度密切依賴于研究起源使用的糞便和要檢測的沙門氏菌菌株。此方法篩選成本非常低，如果在Selekta富集中的孵育時間延長，該方法可進一步提高其靈敏度。Whyte P等人[3]研究原始肉雞屠體中沙門氏菌的流行情況并對其進行了一項調(diào)查，在商業(yè)肉雞屠宰設施的40個雞群中共獲得198個頸部皮膚樣品。通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和沙門氏菌特異性聚合酶鏈反應（PCR）測試評估沙門氏菌的存在。使用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法從所有樣品中的32個（16%） 回收沙門氏菌。相比之下，PCR測定證明更敏感，并且在38個（19%） 測試樣品中檢測到沙門氏菌DNA。當組合培養(yǎng)和PCR結(jié)果時，在198個樣品中的45個（23%）中檢測到病原體。當檢測到雞群中的沙門氏菌時，PCR檢測的靈敏度也大于培養(yǎng)物（通過PCR檢測53%的雞群，通過培養(yǎng)檢測30%的雞群）。2項測試的結(jié)合顯示，55%的雞群被沙門氏菌感染。PCR檢測證明是檢測沙門氏菌的高度特異性和靈敏的方法，并且結(jié)合標準培養(yǎng)和常規(guī)PCR檢測可以有效地提供肉雞胴體中該病原體流行的更準確的概況。

盡管定量聚合酶鏈反應（qPCR）導致了微生物檢測的進步，但由于PCR抑制劑的存在，復雜的環(huán)境樣品（如沉淀物）仍然是一個挑戰(zhàn)。水生沉積物積聚顆粒結(jié)合的微生物污染物，從而反映累積的微生物負荷隨時間的變化。相對較新的液滴數(shù)字PCR（ddPCR）已成為一種直接定量方法，對PCR抑制劑具有高度耐受性，并放棄了校準/標準曲線的必要性。Singh G等人[4]研究比較了ddPCR與qPCR在南非德班非正式定居點附近的Palmiet和沉積物中沙門氏菌的定量分析。與qPCR相比，ddPCR顯著提高了分析靈敏度和低濃度沙門氏菌的檢測。從qPCR和ddPCR測量的預期拷貝數(shù)顯示出良好的R2值（分別為0.999和0.994）。主要受非正規(guī)定居點影響的部位在qPCR和 ddPCR中分別表現(xiàn)出 255±37和818±30沙門氏菌/g（p＜0.000 1） 的沙門氏菌。用ddPCR改進沉積物中沙門氏菌的檢測，使其成為多種環(huán)境樣品中沙門氏菌定量的有前途的技術方法。

1.2 基因芯片技術

基因芯片技術是分子生物學與計算機應用的一種融合，是指DNA片段經(jīng)過CR擴增之后，基于核酸雜交原理，將這些基因序列標記為未知靶基因序列，將其與集合了大量已知序列探針的基因芯片上特定的基因位點上的探針進行雜交，再通過檢測雜交信號來對基因信息進行分析。一次可對大量核酸分子進行檢測分析，彌補了PCR免疫雜交等只限于檢測一種或少數(shù)幾種靶標微生物或基因。

陳昱等人[5]利用多重PCR和基因芯片技術檢測和鑒定沙門氏菌，選取編碼沙門氏菌腸毒素（stn）基因設計引物和探針，進行三重PCR擴增，產(chǎn)物與含特異性探針的芯片雜交。對7種細菌共26株菌進行芯片檢測，僅3種菌得到陽性擴增結(jié)果，證明該方法具有很高的特異性。對模擬食品樣品進行直接檢測，結(jié)果與常規(guī)細菌學培養(yǎng)結(jié)果一致，檢測限為50 CFU/mL。沙門氏菌基因組DNA和細菌純培養(yǎng)物的檢測靈敏度約為8pg。McquistonJR等人[6]開發(fā)了一種基于沙門氏菌DNA的測定，利用其靶向編碼Kauffmann-White血清分型鞭毛抗原（fliC和fljB）的基因。研究結(jié)果表明，在測定中檢測到的36種抗原正確鑒定了461種（92.2%） 分離物。在被認為正確鑒定的分離株中，47個（9.4%） 是部分血清型。未正確鑒定的39種（7.8%）菌株具有應該通過測定檢測到但未檢測到的抗原。分子檢測結(jié)果與傳統(tǒng)方法相比具有更高的通量，同時保持了Kauffmann-White血清分型方案的完整性。張蓓蕾[7]利用糖芯片技術快速檢測沙門氏菌，制作不同類型的糖芯片用于優(yōu)化糖芯片檢測條件，通過降低糖濃度或細菌濃度確定糖芯片檢測限值，研究了糖芯片在沙門氏菌和凝集素FimH拮抗劑篩選上的應用。研究結(jié)果表明，沙門氏菌可與甘露糖化合物修飾的糖芯片結(jié)合，其中，以Man-1與NHS玻片所構(gòu)建的糖芯片效果最優(yōu)，并且2種不同的沙門氏菌（ATCC31685和ATCC9184）與糖芯片的結(jié)合能力不同，因此糖芯片可作為沙門氏菌的一種快速檢測手段，在糖濃度為313 mmol/L或細菌濃度1×106CFU/mL時熒光信號接近背景值。

1.3 免疫磁珠檢測沙門氏菌

免疫分析檢測技術是在免疫學理論基礎上，利用抗原-抗體反應的特異性，免疫放大技術來鑒別細菌。建立的沙門氏菌免疫學檢測方法大致可分為酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、免疫磁珠分離技術、免疫熒光法，在此基礎上還可以利用乳膠凝集、免疫傳感器、免疫擴散、免疫印跡及免疫色譜技術等方法檢測沙門氏菌。

Hyeon J Y等人[8]首次嘗試將免疫磁性分離（IMS），通過多重置換擴增（MDA） 的全基因組擴增和實時PCR結(jié)合用于檢測食物樣品中的細菌病原體。該方法可有效實現(xiàn)原始雞胸中低水平腸道腸炎沙門氏菌（SE） （6 510 CFU/g） 的實時PCR檢測，無需培養(yǎng)富集。此外，在4 h培養(yǎng)富集后，能夠檢測到生雞胸中較低濃度（650.1 CFU/g）的冷藏應激SE細胞，將檢測過程從數(shù)天縮短至數(shù)小時，檢測率無顯著差異與基于培養(yǎng)的檢測方法相比。與傳統(tǒng)的實時PCR相比，通過顯著提高SE檢測的性能，證明了IMS-MDA實時PCR作為檢測食品中沙門氏菌的快速、靈敏且經(jīng)濟方法的潛力。

沙門氏菌大約有2 400種血清型，然而95%引起沙門氏菌病的菌株是屬于血清群A±E的40種血清型。常規(guī)的預濃縮肉湯，選擇性濃縮肉湯和濃縮液差異瓊脂需要72±96 h才能實現(xiàn)沙門氏菌的假定鑒定。然而，免疫磁分離（IMS） 取代了24 h選擇性富集使用順磁顆粒進行10 min免疫捕獲程序。然而，該程序需要在選擇性培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)作為終點檢測點。因此，結(jié)合通過IMS選擇性固定靶細胞和第二檢測抗體的基于ELISA的末端檢測方法將是非常有利的。Mansfield L P等人[9]將IMS技術與基于ELISA的程序結(jié)合使用沙門氏菌屬特異性單克隆抗體M105。該抗體特異于沙門氏菌脂多糖的外核心區(qū)域，因此，它與沙門氏菌Ra粗突變體的LPS上的表位結(jié)合，而不與Rc或Re沙門氏菌粗突變體的LPS結(jié)合。Zhang S等人[10]制備了沙門氏菌特異性抗體，并建立快速檢測肉制品中沙門氏菌的ELISA系統(tǒng)。研究用6種致病性沙門氏菌制備的抗原免疫BALB/c小鼠和兔；用雜交瘤技術進行細胞融合。結(jié)果表明，獲得了1株雜交瘤（6E7CGMCC10313）穩(wěn)定分泌單克隆抗體（M23） 和多克隆抗體（P23）。制備的高純度抗體滴度為1∶1.28×106和1∶8.0。P23作為包被抗體吸附在96孔微量滴定板上，用辣根過氧化物酶標記M23。建立夾心ELISA檢測肉樣品污染。LOD為800 CFU/g。該ELISA系統(tǒng)靈敏度高，具有良好特異性，研究適用于肉類定性和半定量快速檢測沙門氏菌。

1.4 免疫熒光檢測

免疫熒光檢測是將免疫學檢測方法與熒光標記技術相結(jié)合，具體操作是先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體（抗原），再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內(nèi)的相應抗原。Pandey S K等人[11]研究了一種新的夾心型熒光免疫分析格式，使用多黏菌素B，一種陽離子受體分子，作為黏合劑，而抗Vi抗體作為特異性檢測沙門氏菌血清型傷寒沙門氏菌的捕獲劑。針對Vi-BSA綴合物產(chǎn)生的抗ViIgG抗體顯示出7.779 nM-1的親和力，表示Vi多糖中O-乙酰基的免疫顯性。所開發(fā)測定的檢測限為約101細胞mL-1的Vi表達腸炎沙門氏菌血清型Typhi，相關系數(shù)（R2）等于0.97。對于所有測試的血清型Typhi臨床分離株以及加標血液樣品的病原體獲得的陽性反應推薦Vi抗原作為傷寒期間的生物標志物的特異性和準確性。Vi加標樣品的批內(nèi)和批間精密度均令人滿意，顯示方差系數(shù)（CV%），平均值分別為4.05%和5.97%。

1.5 傳感技術檢測鑒定

以傳統(tǒng)方法為基礎，金屬有機骨架材料是由金屬離子或金屬簇和有機配體通過自組裝而形成的一類新型納微結(jié)構(gòu)功能材料，制備熒光生物傳感器。利用核酸適配體的高親和力與高特異性識別能力，可快速、準確可靠、靈敏、特異性高檢測沙門氏菌。目前，用于沙門氏菌檢測的傳感器包括酶傳感器、免疫傳感器、電化學生物傳感器、基因傳感器和光敏傳感器等。

蔣曉華等人[12]基于金屬有機骨架材料的熒光猝滅特性以及對核酸適配體的吸附性，結(jié)合核酸適配體的高親和力與高特異性識別能力，構(gòu)建了針對沙門氏菌檢測的熒光生物傳感器。利用金屬有機骨架材料-核酸適配體熒光法檢測沙門氏菌。研究結(jié)果表明，構(gòu)建的熒光傳感器的信號與沙門氏菌濃度的對數(shù)在1×101～1×105CFU/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系，檢出限（S/N=3） 為7 CFU/mL，將該方法用于蝦肉樣品中沙門氏菌的檢測，加標回收率為90.0%～108.0%，該傳感器對沙門氏菌有較好的選擇性與靈敏度。Fei J等人[13]將電化學免疫傳感器用于雞傷寒沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌的快速檢測。通過制備的傳感器用于捕獲抗體、提高信號強度的金納米粒子的電沉積。捕獲結(jié)果表明對雞傷寒沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌的檢測限均為3×103CFU/mL。該研究中提供的電化學免疫傳感器敏感性高、特異性強，且重復性好的沙門氏菌檢測方法。

1.6 其他技術檢測沙門氏菌

為了彌補單一檢測技術的不足，研究者們將各種檢測技術，如光譜技術、電化學技術、納米技術、傳感技術、電子顯微技術和以微生物代謝為基礎的阻抗法等相互結(jié)合，為檢測和鑒定致病性沙門氏菌帶來了新契機。高分辨熔解曲線檢測是在PCR擴增之后，利用擴增產(chǎn)物的差別，它們產(chǎn)生的熔解曲線也會發(fā)生變化，通過識別熔解曲線的變化來區(qū)分產(chǎn)物，核酸序列的遺傳差異，進而憑借熔解曲線數(shù)據(jù)對來源不同的沙門氏菌進行分類和分型。

Zeinzinger J等人[14]基于fljB，gyrB和ycfQ片段中的特定單核苷酸多態(tài)性，開發(fā)了三重基因掃描測定法并評估了腸道沙門氏菌分離株的血清型特異性亞型分析。通過對含有46種不同血清型的417株沙門氏菌分離株進行高分辨率熔解曲線分析，同時對fljB，gyrB和ycfQ進行基因掃描，可以對37種血清型進行明確、簡便、快速的鑒定。開發(fā)的閉管三重高分辨率熔解曲線測定結(jié)合腸炎沙門氏菌特異性PCR，代表了一種改進的方案，用于準確、經(jīng)濟、簡單、快速地分型39種沙門氏菌血清型。

Fei Jia等人[15]將納米技術、電子顯微技術及電化學阻抗譜等技術于一體，將氧化還原石墨烯的納米復合材料 （rGO） 和羧基改性的多壁碳納米管（MWCNTs）直接固定在玻碳電極表面，利用沙門氏菌的氨基修飾的特異性核酸適配體與rGO-MWCNT通過酰胺鍵共價結(jié)合。通過透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡來觀察描述rGOMWCNT的形態(tài)，利用電化學阻抗譜監(jiān)測。研究結(jié)果表明，此裝置可實現(xiàn)沙門氏菌的量化檢測，檢測范圍75～7.5×105CFU/mL，檢測限為25 CFU/mL，檢測時間為1 h。

2 結(jié)語

沙門氏菌病對動物及人體都會造成一定的病菌感染，應對其防治加以重視。隨著人們對沙門氏菌關注度的提高，沙門氏菌檢測及鑒定也得到了不斷發(fā)展，利用傳統(tǒng)方法，諸如分子生物學檢測、生化檢測、免疫學檢測。耗時較長、操作過程復雜，不能及時給出食品安全性評價。現(xiàn)代分子生物學檢測雖然快速、準確、靈敏、特異性較強，但對設備、技術人員、環(huán)境要求較高，難以推廣普及。每一種檢測技術都有一定的優(yōu)缺點，目前有較多新型的沙門氏菌檢測方法，應對檢測方法進行交叉使用，各取其優(yōu)點。