葡萄酒揮發性成分及其分析方法研究進展

杜芬妮，賈 潛，陳 露，李 翔，莫開菊

（1.湖北民族大學生物科學與技術學院，湖北恩施445000；2.湖北省恩施市國家富硒產品監督檢驗中心，湖北恩施445000）

葡萄酒是酵母通過發酵漿果或葡萄汁中的糖分得到的酒精度介于啤酒與白酒之間的果酒[1]。其起源于以中國為代表的遠東古文明國家，后傳至英法等歐洲國家，在15—16世紀由航海家傳播至南北美洲、澳洲等國家[2-3]。放眼世界，頂級酒莊如法國的羅曼尼-康帝酒莊，西班牙的貝加西西里亞酒莊和美國的圣密夕酒莊等產出的葡萄酒享譽世界，其品質為葡萄酒行業樹起一面旗幟。轉眼國內，知名葡萄酒品牌“張裕”于2017年榮登全球最受歡迎葡萄酒品牌榜單[4]。但我國近幾年葡萄酒總產量持續下降，與之相反，市場規模卻大比例增長，導致葡萄酒進口數量猛增。造成這一現象的主要原因之一是我國葡萄酒品種單一，產品同質化現象嚴重[5]。因此，研究葡萄酒風味有利于促進形成風味各異的葡萄酒種類并穩定和提高其品質，有利于促進葡萄酒產業健康穩定的發展。隨著現代儀器分析技術的發展與成熟，越來越多的對香氣有突出貢獻的風味化合物被分離鑒定，使人們對葡萄酒的認知越來越深入，也越來越期望通過現代技術提高和穩定葡萄酒的風格。因此本文從葡萄酒的不同產香階段著手，總結不同類型葡萄酒中的特征性及主體風味成分，并將現代多種風味成分的分析技術特點進行闡述，以達到全面深入了解葡萄酒風味及現代分析手段的目的，為更好地研究葡萄酒風味和提高其品質打基礎。

1 主要香氣成分

葡萄酒的香氣成分極為復雜多樣，已鑒定出800多種，其種類和濃度差異使得葡萄酒的風味各有千秋。研究香氣化合物產生途徑及不同酒體間的風味差異產生的原因對葡萄酒加工環節的修正及優化有積極的引導作用，同時對采用新的生物技術手段構建葡萄酒的整體風格也有重要的指導意義。

葡萄酒有三類香氣，一類香氣為來自于原料本身的鍵合態和非鍵合態化合物，這類化合物往往為葡萄果實的次生代謝產物，非釀造過程產生，通常被認定為原料的特征果香，形成葡萄酒的特征性風味化合物[6]；二類香氣是葡萄酒主要的風味化合物，在酒精發酵與蘋果酸-乳酸發酵階段產生[7]；三類香氣產生于陳釀過程，此時葡萄酒各化學成分之間相互協調，主要發生氧化反應、酯化反應、聚合反應等，同時用于貯存葡萄酒的不同材料木桶的香味傳遞于酒體，達到豐富風味的目的[8]。

1.1 發酵前階段

葡萄中的果香化合物主要有萜類化合物和C13降異戊二烯類化合物，它們是葡萄的次生代謝產物，在葡萄皮中含量豐富，且具有很低的感官閾值，不被酵母所代謝，在釀酒過程中轉移至酒體[9]，如芳樟醇、橙花醇、香茅醇和β-大馬酮等廣泛存在于葡萄酒中。不少葡萄酒中特有的萜類和C13降異戊二烯類化合物可為一定種類范圍內的葡萄酒的甄別提供重要依據。例如蛇龍珠葡萄酒特有的4-萜品醇為酒體提供胡椒香[10]；吐葉醇為坦納特葡萄酒所獨有[11]；霞多麗葡萄酒中特有的法尼醇為酒體提供丁香及仙來花香味[12]；雷司令葡萄酒所特有的香葉醇賦予酒體溫和、甜的玫瑰花氣息[13]；西西里島麝香葡萄酒所特有的β-蒎烯是酒體中松香氣味的主要來源[14]；維奈西卡葡萄酒所特有的苧烯為酒體提供類似檸檬的香味[15]；西拉葡萄酒所特有的順式-玫瑰醚為酒體提供強烈的玫瑰、香葉香氣[16]；赤霞珠葡萄酒中所特有的2-莰醇為酒體提供類似樟腦的氣味，廣泛用于配制迷迭香、熏衣草型的香精香料[17]；品麗珠所特有的石竹烯具有溫和的丁香香氣，同時還有長葉烯也常用于制備香精香料[18]。除了各原料中的特異性風味成分的差異外，一些普遍存在于原料中的成分，其濃度隨品種不同也有很大差異，因而產生了風味各異的葡萄酒。葡萄酒的命名通常冠以其原料品種名，這充分體現了原料對葡萄酒特征性風味的重要貢獻。

與此同時，這兩類化合物也可存在于糖基化的無香氣的鍵合態前體中，在酒精發酵過程中通過酶解釋放[19]，如一些苯乙基或它們的衍生物從糖苷香氣前體物質中釋放出來，或通過原質體中莽草酸途徑形成，如4-乙基苯酚、愈創木酚、丁香酚等，因此，這些化合物也被列為非發酵芳香化合物[20]。

1.2 發酵階段

乙醇是通過酒精發酵產生的，在酒香氣的呈現中起重要作用。除乙醇外，主要有高級脂肪醇、芳香醇及二元醇，依其種類和濃度的不同，使葡萄酒呈現不同的整體風味[21]。葡萄酒中的高級醇通過酵母酒精發酵途徑或由相應氨基酸的降解代謝途徑生成，作為次級代謝產物釋放到酒體中[22]，濃度通常為400～500 mg/L。低于300 mg/L時，有助于提高葡萄酒香氣的復雜度，但高于500 mg/L時，除2-苯乙醇外，對葡萄酒的質量可能有消極作用[23]。己醇由己醛還原而產生，并賦予酒體草本屬性[24]，使葡萄酒具有“植物性”和“草本”的細微差別，當它的濃度高于其氣味閾值時，通常對葡萄酒的品質有負面影響[25]。異戊醇、苯乙醇分別由亮氨酸（和異亮氨酸）、纈氨酸與苯丙氨酸的降解生成，或由丙酮酸進入氨基酸生物合成途徑后形成α-酮酸中間體，再由相應的酶催化后形成[26]。其中，異戊醇可提供持久的青草，植物香氣[27]。2,3-丁二醇的氧化產物3-羥基丁酮和丁二酮可作為食用香精食用，其中，2,3-丁二醇也作為我國白酒添加劑以達到改善風味的目的。

羰基化合物（醛和酮）可由兩種途徑形成：不飽和脂肪酸的降解和氨基酸在氧存在條件下的部分降解，此外，酮也可以通過真菌對脂質或氨基酸的酶作用產生[28]。在葡萄酒中普遍存在的乙醛有類似堅果或干果的香味；壬醛在中等水平表現出強烈的脂肪-花香氣味；癸醛賦予酒體茶葉香味，使人產生爽快的感覺。

脂肪酸是形成酯、醇和醛的前體物質。同時可防止相應酯的水解，它們對于葡萄酒的芳香平衡是非常重要的。表現出強烈的酸味的短鏈脂肪酸，會掩蓋葡萄酒中的其他香氣，適宜濃度的脂肪酸可使酒體展現最佳風味[29]。如乙酸是葡萄酒中的主要脂肪酸，由酒精發酵和蘋果酸-乳酸發酵過程中的乙醇氧化反應產生。辛酸在脂肪酸合成酶的作用下產生，低濃度時散發出類似奶酪和奶油的風味，在高濃度時具有腐敗味和刺激味，這些酸類物質對葡萄酒的整體風味結構具有較重要作用。

酯主要通過醇與有機酸的酯化形成。此外，發酵過程中酵母和其他微生物的存在也會導致酯類的產生，主要有乙酸酯和中鏈脂肪酸酯兩大類。它們大多數都具有典型果香，賦予酒體果香氣息。其中乙酸酯類化合物的酰基衍生自乙酸（以乙酰輔酶A的形式），醇基團是乙醇或復合醇[30]。在酒精發酵過程中，它們是由不同的醇乙酰轉移酶合成。乙酸異丁酯由異丁醇與乙酸酯化生成，賦予酒體果香或花香味。醋酸異戊酯具有類似于香蕉和梨的香氣。中鏈脂肪酸酯是由中鏈脂肪酸與乙醇形成的[31]。在釀酒酵母發酵過程中，乙酯的形成歸因于酰基CoA:乙醇O-酰基轉移酶[32]。其中普遍存在于葡萄酒中的乳酸乙酯有較強的酒香氣味，但濃度太高，會掩蓋葡萄酒新鮮的果香氣味。琥珀酸二乙酯有濃郁的水果香。葡萄酒中乳酸乙酯和琥珀酸二乙酯揮發性較低，且感官閾值都相對較高，雖廣泛存在，但對酒體整體香氣貢獻不大。而丙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、異丁酸乙酯、異戊酸乙酯[33]等化合物大多具有較低的閾值，主要是在酒精發酵的第一階段生產，并賦予酒體綠色蘋果、梨和菠蘿的芳香。乙酸乙酯的香氣在新生產的葡萄酒中最為突出，有助于葡萄酒中果味的總體感知，對葡萄酒的整體貢獻較大。

1.3 陳釀階段

葡萄酒在陳釀過程中，所用容器中的香氣物質遷移至酒中；封閉環境下氧氣總含量（酒所溶解的氧和液面空間上的氧）與醇、醛等化合物發生氧化作用；各化學組分的動態平衡反應，最終使葡萄酒趨于穩定。

橡木桶用于葡萄酒的陳釀由來已久，其化學組成和結構特征影響著陳釀階段的物理、化學和生物進程。在陳釀過程中，來自橡木本身的香氣成分轉移至酒體，這類化合物中最為重要的是鞣花單寧，一般占木材芯干重的10%左右，它們進入酒體后通過縮合、水解和氧化反應緩慢而連續地生成乙基衍生物及黃烷-鞣花單寧等化合物[34]，此外橡木中的多糖、半纖維素和纖維素的降解所產生的γ-丁內酯、威士忌內酯、丁香酚、愈創木酚和呋喃甲醛、內酯及小分子揮發性物質轉移至酒體[35-36]，這些物質間的協同作用為葡萄酒增添橡木香氣[37]。

透氧率作為橡木桶的結構特征影響著葡萄酒中因氧化存在的兩類香氣變化：氧敏感芳香化合物的氧化（如硫醇）和新的芳香化合物氧化生成（如乙醛、苯乙醛、2-甲基丙醛等）[38]。3-巰基乙醇通常是葡萄酒含量最豐富的多官能團硫醇，具有熱帶水果香氣，在貯藏一年左右時發生氧化，含量急劇下降[39]。乙醇在葡萄酒中經氧化形成乙醛，進一步與單寧或花青素結合形成乙基鍵合物，氧化過程使酒體的水果和發酵香味消減，氧化香味增強。葡萄酒氧化過程不僅局限于在橡木桶中貯存的階段，大多數研究表明，瓶貯過程中木塞的選擇對葡萄酒發酵后階段的氧化香氣也有深遠影響[40-42]。陳釀過程中，糖苷的酸水解可以增加酒體中萜烯的成分，賦予葡萄酒更多獨特的果香[43]，這個過程所釋放的去甲基異戊二烯類、單萜類和倍半萜類化合物是酒體煙草香和香料香氣的主要貢獻者[44]。

發酵階段酒體所含有的酯類物質將在陳釀階段經歷酯化-水解的動態平衡過程，乙酸酯通常比脂肪酸乙酯水解速度更快[45]，支鏈脂肪酸乙酯相較于直鏈脂肪酸乙酯（己酸乙酯等），由于其較弱的揮發性在酒中含量相對增多[46]，長鏈脂肪酸乙酯的含量總體呈增加水平，酒石酸與乙醇之間的酯化使得酒石酸乙酯含量上升[47]。此外，外界條件如時間和溫度等也影響著葡萄酒香氣成分的動態平衡[48]。

葡萄酒風味是一個龐大的體系，受原料的選取，釀造方式的差異及陳釀條件的影響。圍繞風味化合物的研究之所以能如火如荼地開展，得益于各種樣品前處理技術的發展及氣相色譜高效的分離功能。

2 風味化合物的分析方法

2.1 分析方法

食品的風味成分往往是不同種類、不同濃度揮發性化合物的集合體。在氣相色譜誕生之前，要完成這些化合物的分離鑒定有著難以想象的工作量，耗時費力，且樣品需求量巨大。但利用氣相色譜與其他檢測器聯用可以很輕松解決這些問題。氣相色譜(GC)是以惰性氣體為流動相，以色譜柱內填料或涂層為固定相，利用固定相對不同化合物的吸附力強弱來實現分離效果，吸附力弱的最先被分離出來，吸附力強的最后流出。由于其分離能力強、靈敏度高、分析速度快，常常是研究食品風味的首選方法。

氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)是將氣相色譜很強的分離能力和質譜很強的鑒定能力結合起來，使得分離和鑒定同時進行。與用化合物的保留性能來定性物質的其他檢測器相比，質譜儀(MS)本身就是一臺有很強定性能力的獨立的儀器，其與氣相色譜儀的聯用也最為成熟，應用也最為廣泛。Ivan ?panik[49]將GC-MS成功用于不同地理來源和加工方式的葡萄酒的鑒別；劉亞娜等[50]以GC-MS對D254、71B、D153種果酒酵母釀造的紅樹莓酒的揮發性成分進行分析，測量出其主要的香味成分，并選定最佳釀酒酵母。全二維氣相色譜技術(GC×GC)是將兩根色譜柱以特定方式連接于調制解調器，通過設置一定的調制時間將一維流出物捕集，聚焦后釋放至二維色譜柱，此分離方法可以在極性差異上實現化合物的分離[51-52]，相較于一維來講具有更高效的分離效能，但需要較為成熟的調制技術。Juliane Elisa Welke等[53]通過GC×GC-OFMS結合主成分分析和聚類分析得出霞多麗葡萄酒和起泡酒之間有119種不同物質，并篩選出87種決定這種差異的最主要的風味物質。Berhane T·Weldegergis等[54]用此方法將取自不同栽培技術原料，用不同釀造方法制備的匹諾奇葡萄酒的揮發性產物進行對比研究，并說明這兩種因素對葡萄酒的影響。

2.2 提取方法

氣相色譜雖然具有高靈敏度、操作簡單等特點，但我們面臨的分析對象卻多種多樣，組成復雜，其中不少成分因在汽化室內的高溫下不能被汽化反而被碳化，進而污染汽化室和色譜柱，干擾后續實驗結果。葡萄酒中含有大量水分，進入柱內會破壞毛細管柱的固定相膜，降低柱效。此外，有些風味物質在樣品中濃度很低，往往低于儀器的檢測限，由于其香味閾值也很低，對整體風味有重要貢獻，所以測定時不能因為其濃度低而忽視其存在，有必要對樣品進行濃縮富集。因此樣品的預處理是保證儀器分析結果準確性的重要步驟。

在葡萄酒的風味化合物的提取方法中，液液萃取(LLE)利用樣品中不同組分在兩種互不相溶的溶劑中溶解度的不同來達到分離的目的，因氣相色譜分析要求盡可能含水少，而待測成分又常常在有機溶劑中有較大的溶解度，所以它經常作為一種提取風味成分的方法。曾游等[55]通過這一方法對葡萄酒中主要風味化合物進行提取，定性定量分析結果表明，該方法有較好的重復性。同時蒸餾萃取(SDE)將蒸餾與萃取兩步驟同時進行，以實現對樣品中揮發性與半揮發性物質的快速提取，不僅節約時間，而且提取效果較好[56]。Eun-Ha Chang等[57]通過SDE對葡萄酒中風味化合物進行提取，分析出原料和成品之間共有的風味化合物是酯類、酮類和內酯；攪拌子吸附萃取(SBSE)為一種小型的，集萃取和富集于一身的萃取方式，有研究者指出，SBSE有極低的檢測限，同時無需溶劑[58]。A.Zalacain等[59]通過優化萃取條件，成功總結出用于區分西班牙西南部6種白葡萄酒的主要香氣化合物的萜烯類，C6化合物和C13-降異戊二烯類化合物。固相萃取(SPE)是一種基于液-固分離萃取的試樣預處理技術，由柱液相色譜技術發展而來，自70年代后期問世以來，由于其高效，可靠及耗用溶劑量少等優點得到快速發展，其采用有高效選擇性的固定相，簡化了樣品的預處理過程，主要用于樣品分析前的凈化和富集。馬玥、唐柯、徐巖等[60]通過固相萃取提取同一年份不同等級的威代爾冰葡萄酒中風味化合物，發現其主要香氣化合物的差異在于濃度不同，表明釀造工藝對酒體整體風味具有較大影響。頂空固相微萃取(HS-SPME)是20世紀90年代由Pawliszyn等首先提出的一種新的樣品處理技術，利用固-氣建立的吸附或吸收平衡原理，集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體，操作簡便，因其已成功地與氣相色譜和氣質聯用結合使用，是目前應用最廣泛的樣品預處理技術。Butkhup等[61]證明，50/30 μm DVB-CAR-PDMS萃取頭對葡萄酒中的高級醇、脂肪酸和酯類具有較高的提取率。MA等[62]通過HSSPME對青梅露酒、青梅汁、青梅釀造酒的香氣成分進行提取，成功分析出決定各產品獨特風味的香氣成分及其主要的香氣成分；Azzi-Achkouty等[63]總結了近年來用HS-SPME提取葡萄酒中揮發性成分的方法條件，發現其有很高的靈敏度，可滿足對低含量物質的檢測。但加鹽量、萃取溫度、時間、萃取頭類型等條件需要進一步優化以得到較好的實驗結果。

陳臣等[64]通過對比研究頂空固相微萃取(HSSPME)和液液萃取(LLE)對歐李果酒中風味化合物的提取效果，發現HS-SPME適合萃取痕量易揮發成分，而LLE適合于含量較高的醇的提取。張莉[65]經SBSE和HS-SPME對葡萄酒揮發性成分提取效果的對比研究后，發現SBSE較HS-SPME在提取物的種類和數量兩方面上都具有較高的提取效率。夏亞男[66]通過LLE、SDE和HS-SPME 3種方法對紅棗白蘭地的揮發性成分的萃取結果得知，LLE對烴類、醛酮、酸酯有較好的提取效果，HSSPME對醇和萜烯有較好的萃取結果，而SDE的萃取結果在種類和數量兩方面都明顯遜色于前兩種方法。所以針對研究目的的不同，需對每一種萃取方法及樣品的特點有了解，以選擇合適的試驗方法。

3 展望

風味是葡萄酒的重要特征之一，由一系列種類各異的揮發性化合物按不同的比例組成并決定葡萄酒的質量。借助儀器分析闡明產品的特征風味組成，從而形成某產品的固有風格，無疑對產品的質量穩定性和獨特的商品性起到不可估量的作用。隨著風味化合物的提取及分離分析方法的不斷進步，將推動研究工作向更高效、快速、精準的方向發展，揭示葡萄酒香氣成分的組成，將促進生產者從多角度、多階段、多手段，有目的的去構建葡萄酒風味，豐富葡萄酒的種類，突出其特征特色，減少同質化，使葡萄酒品種異彩紛呈。