兔病毒性出血癥的診斷

劉健

（山東省平邑縣畜牧獸醫局平邑畜牧獸醫站 273300）

1984年，中國南方省份首次報道了一種急性出血性兔病。隨后迅速傳播到華南和華北部分地區。該疾病的特征是急性起病，發熱，呼吸急促和猝死，發病率和死亡率都很高。該疾病被命名為兔病毒性出血癥，病原體是小核糖核酸病毒。使感染兔子的肝臟、肺臟、脾臟和腎臟均質化并用甲醛滅活來制備組織來源的疫苗。

1 兔病毒性出血癥概述

兔病毒性出血癥可攻擊在密集條件下飼養的兔子。本病的主要傳染源是病兔和帶毒兔。健康兔與之接觸可感染，也可通過病兔和帶毒兔污染過的飼料、飲水、用具間接傳染，或經呼吸道或黏膜感染。各種家兔均有易感性，其中以長毛兔最易感[1]。實驗感染后潛伏期約為20～48h。自然病例中，潛伏期為數小時至1～2d。自然發病率爆發率為70%～80%，受影響的兔子死亡率高達95%。不同地區的疫情表現出許多相似之處，可分為3類，超急性形式、急性形式和亞急性形式。

超急性形式兔病毒性出血癥通常在首次引入疾病時出現。受感染的兔子經常沒有任何臨床突然死亡。偶爾會出現鼻孔出血和陰道出血現象。急性兔病毒性出血癥在疾病流行地區占主導地位。受感染的動物通常表現出抑郁，不愿意移動和厭食。在疾病早期和發展階段，體溫通常升高至41℃或更高，然后在終末期降至正常水平以下。大多數動物具有快速呼吸和發紺。一些動物表現出腹脹，便秘、腹瀉和血尿。最終，這些動物變得斜躺，并使用四肢劃動，有些動物在抽搐期間死亡。大約20%受影響的兔子鼻孔出現泡沫狀出血。急性兔病毒性出血癥的病程在12～36h。亞急性兔病毒性出血癥經常在流行病后期階段遇到。兔子表現出抑郁，厭食和高體溫，身體消瘦，最后衰竭死亡。這些動物具有感染性，易感染其他家兔。

2 診斷方法

2.1 病毒分離

病毒的分離與鑒定是診斷兔病毒性出血癥病毒比較準確、可靠的方法。將無菌采集的病死兔肝臟等組織經過一系列處理，取上清液過濾除菌后接種無兔病毒性出血癥疫苗免疫史和感染史的成年健康易感家兔，并設立對照組。觀察兔發病情況，判斷是否為兔病毒性出血癥病毒感染。對分離得到的病毒還需進行血凝試驗、電鏡觀察、RT-PCR等操作來做進一步鑒定。

2.2 血凝和血凝抑制試驗

兔病毒性出血癥病毒只有一種血清型，只能凝集人的“O”型紅細胞，而不凝集其他動物，如馬、牛、羊等的紅細胞，這種凝結性質比較穩定。在一定范圍內不受溫度、有機溶劑及某些無機離子的影響。血凝和血清抑制試驗在兔病毒性出血癥的診斷、兔群免疫監測等方面得到廣泛應用，但由于血凝和血清實驗需要人“O”型紅血球制備紅細胞，樣本血清需經吸附處理、試驗操作煩瑣、可重復性差，在實際應用中受到限制。

2.3 RT-PCR方法

RT-PCR技術具有靈敏、特異、快速、簡便等優點，是實驗室常用的分子生物診斷技術，也是目前檢測兔病毒出血癥病毒的主要方法。RT-PCR技術主要包括常規RT-PCR方法、套式RT-PCR方法和多重RT-PCR方法。常規RT-PCR方法可以實現兔病毒出血癥與其他豬病原體的鑒別檢測。套式RT-PCR是PCR的一種改良模式，具有更高的特異性和敏感性。隨著現代養殖業的發展，兔群多病原混合感染的情況越來越普遍。多重RT-PCR具有特異性強、靈敏度高等優點而且可以同時檢測多種病原體。

2.4 FQ-PCR方法

實時熒光定量PCR（Real-time fluorescenquantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR）方法是在PCR技術基礎上發展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術，是一種新型分子生物學診斷技術。熒光定量RT-PCR技術因為定量準確，具有較高的靈敏度和較強的特異性等優點，成為核酸檢測的重要工具，為兔病毒出血癥的診斷提供了新的模式。

2.5 酶聯免疫吸附免疫實驗

酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）主要包括抗原ELISA檢測方法和抗體ELISA檢測方法。抗原ELISA檢測方法靈敏度高、特異性強、經濟快捷，為檢測兔病毒性出血癥病毒開發奠定了強有力的基礎。抗體ELISA法具有靈敏度高，特異性強，易于規格化和標準化，在國內外廣泛用于細菌、病毒及寄生蟲抗原和抗體的檢測[2]。

2.6 膠體金免疫層析技術

膠體金免疫層析技術（Gold immunochromatography assay，GICA）是層析法與免疫膠體金技術相結合的診斷技術，具有巨大的發展潛力和廣闊的應用前景[3]。該方法為兔病毒性出血癥的現場診斷提供了有效方法，顯示出很好的臨床應用前景。

3 小結與展望

兔病毒性出血癥是20世紀末新爆發的兔烈性傳染病，給兔群帶來毀滅性的打擊和極大的危害性，做好兔病毒性出血癥疾病的診斷和預防工作是利國利民的一件大事。在兔病毒出血癥的診斷方法中，病毒的分離與鑒定法是一種準確可靠的診斷方法，但由于操作周期長、實驗煩瑣，不建議在實驗室中采用。FQ-PCR方法的特異性強、敏感性高、檢出率高、且在兔感染病毒的早期即可檢測到病毒核酸，但該方法對操作人員、儀器設備與試劑要求較高。ELISA方法具有敏感性和特異性強、操作簡單、檢測快速、重復性好、無輻射、準確性高的優點，適合基層進行大批量檢測，非常適合基層獸醫部門和廣大養殖戶應用。