手動提取核酸的注意事項

張鵬

（遼寧省丹東市動物疫病預防控制中心 118002）

1 注意個人防護

在實驗過程會使用到裂解液（TRIZOL）、三氯甲烷、異丙醇等化學試劑，大多對人體有害。

2 防止RNA酶的污染

（1）配液室、提取室、擴增室、電泳室所有的器械及防護用品做到專室專用。實驗用的手套、口罩、帽子均為一次性，手套在實驗過程中要經常更換。

（2）所有玻璃在使用前要在180℃的高溫下干烤6h以上。塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗。

（3）配置的溶液應盡可能地用0.1%DEPC，在37℃處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑用DEPC處理過的無菌雙蒸水配置，然后經0.22μl濾膜過濾除菌。

3 實驗過程需要注意事項

（1）采取水泡皮、水泡液、血液（抗凝血）、血清、組織、細胞培養物和口腔分泌物等樣品時，取樣的器材必須經高壓或者干熱滅菌。分離后的樣品在2～8℃條件下保存不能超過24h，-70℃可長期保存，但不能反復凍融3次。

（2）除裂解液4℃保存外，氯仿、異丙醇、75%乙醇在-20℃預冷。試驗需在生物安全柜中進行，每份樣本（1.5ml滅菌離心管）中加入600μl裂解液、200μl待測樣本，再加入200μl氯仿，用手顛倒混勻。于4℃12000g離心15min。在樣品數量較多時，為了避免加樣順序錯誤，可以使移液頭和樣品的位置一一對應，還可以使離心管的管蓋略偏向一邊，加完一份樣品之后把管蓋撥向另一邊。

（3）上清液相轉移到對應的離心管時，可把離心管略微傾斜，在移液頭接觸到上清液面后，緩抬持移液器手的拇指，同時將移液器向下深入，當移液頭快接觸到中間層時停止，眼睛盯住移液頭的尖部，如果發現有白色絮狀物進入，拇指輕壓將其推出，然后停止吸液，這樣可以保證吸取液體中不含DNA和蛋白質，所有樣品轉移完成后切記顛倒混勻。

（4）每一步離心時要注意固定離心管的方向，通常將離心管開口朝向離心機轉軸方向放置，這樣產生的核酸會位于離心管底部靠后的一側，方便后面吸干殘液。

（5）在倒去上清倒置于吸水紙時，吸水紙要有一定的厚度，防止液體滲透到試驗臺上，污染其他樣品，也不要在一張紙上放置過多樣品，防止不小心碰倒離心管時，樣品互相污染。用微量加樣器吸干殘液時不要碰倒離心管后部有沉淀的一面，每份樣品更換吸頭。在室溫下干燥時間不宜過長，否則會導致RNA不易溶于DEPC水。

（6）實驗過程中產生的吸頭應直接打入盛有10%次氯酸鈉的廢物缸內，并與其他廢棄物品一同交由處理醫療廢棄物的專業人員處理。工作臺及各種實驗用品經常用10%次氯酸鈉、75%酒精和紫外燈進行消毒。

以上就是在工作中總結的一點小經驗，希望對大家平時的工作起到一些幫助作用，不足之處還希望大家指正，讓我們為畜牧業的發展保駕護航！