TMPRSS2-ETS融合基因在前列腺導管內癌診斷中的應用

丘佳明,姚文英,王曉燕,魏 煒,林小星,蔡為民,盛仁明

(1.常熟市第二人民醫院 病理科,江蘇 常熟215500；2.常熟市第一人民醫院 病理科)

前列腺癌是老年男性常見的惡性腫瘤。近年來隨著血清PSA篩查和前列腺穿刺活檢技術的完善,前列腺癌及其癌前病變的檢出率越來越高[1]。WHO(2016)泌尿系統和男性生殖器官腫瘤分類中明確列出了前列腺導管內癌(IDC-P)這一新的組織類型[2],而它與高級別前列腺上皮內瘤 (HGPIN)、前列腺浸潤性篩狀癌和前列腺導管腺癌均具有相似的鏡下結構卻有不同的臨床意義[3]。免疫組化方法檢測雞尾酒抗體(P504s+CK34βE12+P63)為目前較常應用于前列腺癌的鑒別診斷方法,但在實際臨床工作中,經常會出現穿刺活檢較小、較破碎的組織,極易出現鑒別診斷困難,而且其中IDC-P與HGPIN免疫表型特點相近,免疫組化檢測對二者鑒別幫助不大[3]。

跨膜絲氨酸蛋白酶2(TMPRSS2)基因與ETS轉錄因子基因家族成員的融合,具有前列腺特異性,并在前列腺癌發生、發展過程中發揮重要作用[4]。ETS轉錄因子基因家族成員包括ERG、ETV1、ETV4這三種基因,他們與TMPRSS2基因的融合,目前認為是前列腺癌中常見的基因突變。本文采用熒光原位雜交技術(FISH)檢測TMPRSS2-ETS融合基因在IDC-P、HGPIN、浸潤性篩狀癌和導管腺癌中的表達,并以良性前列腺增生和正常前列腺組織作為對照,以期為它們的診斷提供幫助。同時采用免疫組化方法標記雞尾酒抗體在它們中的表達,比較FISH與免疫組化在前列腺疾病診斷中的作用,為解決前列腺疾病診斷中的難題提供幫助。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2013年1月至2017年12月送檢至我科和常熟市第一人民醫院病理科的前列腺蠟塊標本及其病理切片,根據WHO(2016)泌尿系統和男性生殖器官腫瘤分類中的診斷標準[2],復習病理切片,選取其中腫瘤成分較多的IDC-P、HGPIN、浸潤性篩狀癌和導管腺癌各40例,以及良性前列腺增生和正常前列腺組織各20例作為對照。

1.2 制備組織芯片

首先對已篩選的病理切片進行觀察,然后在顯微鏡下選取代表性區域,用筆在相應供體蠟塊的相應位置上標記取材部位。另外制備空白蠟塊作為受體蠟塊。應用打孔針取標記組織,放入受體蠟塊上對應的小洞內。每個芯片40個位點,間距為0.2厘米。病變組織按照類別制成五份組織芯片,分別為IDC-P、HGPIN、浸潤性篩狀癌和導管腺癌各一份,以及良性前列腺增生加正常前列腺組織一份。

1.3 試劑

FISH檢測所需ERG、TMPRSS2、ETV1、ETV4基因異常檢測試劑盒(F.01011-01)購自廣州安必平醫藥科技股份有限公司,包括ERG斷裂探針、TMPRSS2-ETV1融合探針和TMPRSS2-ETV4融合探針。免疫組化檢測所需前列腺癌雙染試劑盒(DS-0106)購自北京中杉金橋生物技術有限公司,包括P504s、P63和CK34βE12這三個抗體。

1.4 FISH檢測

取制備好的組織芯片,常規切片,厚為4微米,放入70℃烘箱內1小時,脫蠟采用二甲苯兩缸各5分鐘,脫水采用無水乙醇兩缸各5分鐘,然后室溫風干。接著,先后浸入煮沸的去離子水中40分鐘,37℃蛋白酶K溶液中20分鐘,用檸檬酸鈉緩沖液進行漂洗,梯度酒精(70%、85%、100%)脫水,室溫風干。每張切片滴加10 μl探針液,蓋上蓋玻片,放入原位雜交儀進行變性雜交,設定變性條件為88℃、5分鐘,雜交條件為42℃、16小時。之后,用甲酰胺和SSC溶液浸洗,70%的乙醇脫水,避光室溫風干。滴加10 μl的4,6-聯脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)復染劑,蓋上蓋玻片,避光放置10分鐘,進行鏡下診斷。

1.5 免疫組化檢測

組織芯片的切片脫蠟脫水步驟同FISH,然后放入EDTA溶液(pH8.0)中100℃20分鐘進行抗原修復。先后放入過氧化物酶阻斷劑溶液、正常非免疫動物血清中室溫10分鐘,加雞尾酒抗體,室溫60分鐘。加二抗,室溫15分鐘,加堿性磷酸酶顯色劑,10-20分鐘,加辣根過氧化物酶顯色劑(AEC顯色劑)10-20分鐘,加蘇木素10-20秒,以上每一步驟結束均需PBS溶液沖洗3次,每次3分鐘然后進行下一步驟。最后浸入PBS溶液后可自來水沖洗,烘干封片。

1.6 結果判讀

1.6.1ERG斷裂探針正常信號類型為兩融合(2F),即細胞核內同時存在的兩對紅綠信號點,當出現TMPRSS2-ERG基因融合重排時,信號類型為一紅一綠一融合(1R1G1F)、或者一紅一綠(1R1G)、或者多綠一融合(nG1f)。TMPRSS2-ETV1與TMPRSS2-ETV4融合探針的信號類型相同,正常信號類型為兩紅兩綠(2R2G),典型異常信號類型為一紅一綠兩融合(1R1G2F)。熒光顯微鏡下觀察至少50個腫瘤細胞,<10%判定為陰性,>50%判定為陽性,在10%-50%之間則需另觀察50個腫瘤細胞,兩次結果相加計算百分率,<15%判定為陰性,≥15%判定為陽性。

1.6.2雞尾酒抗體為紅色和棕褐色雙染,P504s呈紅色顆粒狀,定位于腫瘤細胞漿,P63和CK34βE12呈棕褐色,分別定位于基底細胞胞核和胞漿。

1.7 統計學方法

用SPSS20.0軟件對本實驗所得數據進行統計學處理,IDC-P與其它組比較采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FISH方法檢測

2.1.1在IDC-P、浸潤性篩狀癌、導管腺癌三組病例中檢測結果近似,出現TMPRSS2-ERG融合重排信號異常的陽性標本分別為有27例、25例、24例,TMPRSS2-ETV1陽性病例分別為3例、2例、3例,TMPRSS2-ETV4陽性病例分別為1例、1例、0例。TMPRSS2-ETS的相關基因在以上三組病例的總陽性率分別為77.5%(31/40)、70%(28/40)、67.5%(27/40),差異沒有統計學意義(P>0.05)。

2.1.2在HGPIN組病例中,出現TMPRSS2-ERG融合重排信號異常的陽性標本有2例,在未出現TMPRSS2-ERG融合重排的標本中,TMPRSS2-ETV1、TMPRSS2-ETV4均為正常信號類型,未見融合重排信號異常,TMPRSS2-ETS相關基因的總陽性率為5%(2/40)。在良性前列腺增生和正常前列腺組織中,表達與HGPIN組相近,僅出現1例正常前列腺組織TMPRSS2-ERG融合重排信號異常陽性,其余均為正常信號類型。故IDC-P組較HGPIN組、良性前列腺增生和正常前列腺組織病例差異明顯,具有統計學意義(P<0.05)。

2.2 免疫組化方法檢測

2.2.1檢測雞尾酒抗體,其中P504s抗體的陽性率,在IDC-P為75%(30/40),在HGPIN為32.5%(13/40),在浸潤性篩狀癌為100%(40/40),在導管腺癌為95%(38/40),表達呈弱陽性至強陽性。IDC-P組與以上另外三組相比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。在良性前列腺增生和正常前列腺組織中,P504s均陰性,較IDC-P具有明顯差異性。

2.2.2雞尾酒抗體中的另外兩個抗體CK34βE12和P63,在IDC-P和HGPIN表達相似,大部分腺管基底膜可見連續陽性或斷續陽性,陽性率均為90%(36/40),在良性前列腺增生和正常前列腺組織中陽性率為100%(40/40),而它們在浸潤性篩狀癌和導管腺癌病例中大部分表達缺失,出現3例浸潤性篩狀癌和1例導管腺癌病灶中間的少量散在弱表達,視為表達陰性。故對于CK34βE12和P63這兩個抗體來說,IDC-P組與浸潤性篩狀癌、導管腺癌組差異均具有統計學意義(P<0.05),IDC-P與HGPIN組、良性前列腺增生和正常前列腺組織差異均不具有統計學意義(P>0.05)。

3 討論

前列腺導管內癌這個名詞最早是在1972年由Rhamy等[5]提出,經過不斷地研究和總結,發現無論在前列腺手術切除標本還是穿刺活檢標本,IDC-P都與幾種提示預后不良的臨床病理因素存在明確的相關性,包括Gleason評分高、腫瘤體積大、累及精囊腺、前列腺外侵犯和淋巴結轉移等等[6]。WHO(2016)泌尿系統和男性生殖器官腫瘤分類中首次明確列出了IDC-P這一組織類型[2],定義為腺泡上皮和(或)導管上皮的腫瘤性增生,相比HGPIN具有更高的組織學和(或)細胞學的異形性,與高分期、高分級的前列腺癌的發生具有顯著相關性。IDC-P組織學特征是腫瘤細胞局限在導管內或腺泡內,可沿著導管和腺泡進行浸潤播散,并且基底細胞層保存或部分保存。很多學者實驗了不同的方法,將IDC-P與HGPIN、浸潤性篩狀癌、導管腺癌等組織學特征近似的前列腺腫瘤相鑒別[3,7],研究發現,IDC-P與HGPIN具有極為近似的免疫組化表達特點,包括雞尾酒抗體和PSA的表達,常規的免疫染色對于鑒別兩者并沒有幫助,IDC-P與浸潤性篩狀癌、導管腺癌這兩組病例可以分別通過雞尾酒抗體進行鑒別。所以,IDC-P與HGPIN運用常規方法難以鑒別,是目前病理診斷中的難點。

為了對IDC-P和HGPIN進行鑒別,Lotan等[8]和Morais等[9]先后應用免疫組化方法檢測二者腫瘤細胞胞質中與張力蛋白同源的第10號染色體缺失的磷酸酶基因(PTEN),結果均出現PTEN的缺失,分別為84%和76%,而HGPIN的表達正好相反,但該研究尚未通過大樣本量的前瞻性研究證實且敏感性不高,可以作為二者鑒別診斷中的輔助參考指標。Han[10]等和Shah[11]等分析IDC-P和HGPIN具有明顯地組織學相似性,常規診斷標準無法鑒別,在無浸潤性癌的穿刺標本中,基因檢測可幫助鑒別IDC-P和HGPIN,若出現TMPRSS2-ETS融合基因,則傾向IDC-P。該研究與本文研究方法相近,結論近似,均支持FISH檢測TMPRSS2-ETS融合基因在IDC-P和HGPIN鑒別中的重要作用,但該研究樣本量較少,且局限于無浸潤性癌的情況,而實際工作中,IDC-P大部分都伴隨著Gleason評分高、腫瘤體積大的預后不良的浸潤性癌[6],IDC-P是前列腺癌進展的高風險因素,無論是否合并浸潤性癌,均應明確診斷IDC-P,故本文選擇病例并未區分是否伴有浸潤,本文研究結論與該研究相近,說明無論是否伴有浸潤性癌,不影響IDC-P和HGPIN的鑒別。

總而言之,IDC-P與HGPIN、浸潤性篩狀癌、導管腺癌難以鑒別,是目前病理診斷中的難點,運用免疫組化方法檢測雞尾酒抗體可以初步將IDC-P、HGPIN這兩個腫瘤與浸潤性篩狀癌、導管腺癌鑒別,運用FISH檢測TMPRSS2-ETS融合基因可以進一步鑒別IDC-P與HGPIN。