2017年中國飼料原料及配合飼料中霉菌毒素污染調查報告

■周建川 雷元培 王利通 鄭文革 趙麗紅* 計 成

（1.中國農業(yè)大學動物科學技術學院動物營養(yǎng)國家重點實驗室，北京100193；2.河南億萬中元生物技術有限公司，河南鄭州451191；3.浙江天蓬畜業(yè)有限公司，浙江衢州324111）

霉菌毒素是由真菌(霉菌)產生的具有毒性的次級代謝產物。霉菌毒素污染一直威脅著全球畜牧業(yè)和食品工業(yè)的發(fā)展。目前已知的霉菌毒素有數(shù)百種，其中對畜牧業(yè)威脅最大的有黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、T-2毒素、赭曲霉毒素以及伏馬毒素等。玉米、小麥、稻谷等谷物作為人類食物和動物飼料的主要能量供給，現(xiàn)已深受霉菌毒素污染問題的困擾[1]。

目前關于霉菌毒素的檢測方法主要有：薄層色譜法（TLC）、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、氣相色譜法（GC）和高效液相色譜法（HPLC）等[2]，其中對HPLC法相對準確，其用免疫親和柱對經(jīng)過萃取的樣品進行凈化后，雜質少，檢測限低。為了了解我國飼料原料及配合飼料受霉菌毒素污染的情況，中國農業(yè)大學動物營養(yǎng)國家重點實驗室與合作單位采用高效液相色譜法對國內各個地區(qū)的1 034個飼料原料和配合飼料樣品中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素進行了檢測分析，為飼料生產企業(yè)和養(yǎng)殖企業(yè)提供參考。

1 材料與方法

高效液相色譜儀（SHIMADZU LC-20AT）；熒光檢測儀和紫外檢測儀（SHIMADZU RF-20A）；色譜柱為Agilent C18色譜柱，5 μm，4.6 mm×150 mm；色譜工作站（島津高效液相色譜LC工作站）；AFB1、ZEN和DON免疫親和柱，由德國Aokin公司生產。具體操作步驟參考德國Aokin公司霉菌毒素檢測的標準操作程序。AFB1、ZEN和DON標準溶液購自美國Supelco。

2 試驗方法

2.1 樣品采集

2017年，中國農業(yè)大學動物科學技術學院動物營養(yǎng)國家重點實驗室與合作單位分別采集了遼寧、吉林、北京、天津、湖北、湖南、河北、河南、山東、安徽、浙江、江蘇、四川、福建、廣東、廣西等區(qū)域的玉米樣品324個、玉米副產物樣品90個、小麥及麩皮樣品150個、粕類樣品130個和全價料樣品340個，共計1 034個。采樣按照GB/T 14699.1—2005《飼料采樣》[3]的要求執(zhí)行，每份樣品不少于500 g。樣品粉碎后放置于-20℃冰箱中保存待測。

2.2 試樣的制備與提取

2.2.1 樣品前處理

稱取25 g磨碎的飼料原料或配合飼料樣品，置于250 ml錐形瓶中，加入100 ml體積比為6∶4的甲醇水提取液（注：根據(jù)不同霉菌毒素選擇不同的提取液），以高速攪拌提取3 min，靜置，過濾。樣品過濾液使用PBS緩沖液進行稀釋，使甲醇含量不得高于10%，如稀釋后樣品出現(xiàn)混濁，需再次過濾。

2.2.2 凈化

將免疫親和柱上方塞子取出并斜剪斷，再插回免疫親和柱上，上端接上10 ml玻璃注射器筒。摘掉親和柱下方堵頭，放出親和柱中的保護液。加入10 ml樣品濾液過柱凈化，調節(jié)流速為1 ml/min左右。

2.2.3 洗脫

過柱凈化液徹底排凈后，使用10 ml 10%的甲醇水洗脫2次，調節(jié)流速為3 ml/min左右。棄去流出液，最后分兩次各加入0.5 ml甲醇，分別孵育2 min，然后使用1 ml/min左右的流速將毒素洗脫出來，收集洗脫液進行上機檢測。

2.2.4 毒素的檢測

使用免疫親和柱-高相液相色譜法對樣品中的AFB1、ZEN和DON進行檢測。

黃曲霉毒素檢測方法參照GBT 30955—2014《飼料中黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2的測定免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》[4]中的測定方法，并根據(jù)試驗情況進行適當調整。色譜檢測條件：流動相為甲醇∶水（45∶55）；流速為 1 ml/min；進樣量為 20 μl；柱溫35℃；外標法定量；熒光檢測，波長：λex=360 nm，λem=440 nm；出峰時間28 min。

玉米赤霉烯酮檢測方法參照GBT 28716—2012《飼料中玉米赤霉烯酮的測定免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》[5]中的測定方法，并根據(jù)試驗情況進行適當調整。色譜檢測條件∶流動相為乙腈∶水∶甲醇（46∶46∶8）；流速為1 ml/min；進樣量為20 μl；柱溫35℃；外標法定量；熒光檢測，波長：λex=274 nm，λem=440 nm；出峰時間16 min。

嘔吐毒素檢測方法參照GBT 30956—2014《飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定免疫親和柱凈化-高效液相色譜法》[6]中的測定方法，并根據(jù)試驗情況進行適當調整。色譜檢測條件：流動相為乙腈∶水（1∶9）；流速為1 ml/min；進樣量為20 μl；柱溫35 ℃；外標法定量；紫外檢測，波長：218 nm；出峰時間12 min。

3 結果與分析

按照飼料樣品中AFB1、ZEN和DON含量高于檢出限作為檢出，本研究中陽性樣品設定檢出限值如下：AFB10.5 μg/kg、ZEN 1 μg/kg和 DON 10 μg/kg。飼料和原料中AFB1、ZEN和DON允許限量參照我國于2018年5月1日即將實施的新《飼料衛(wèi)生標準》GB 13078—2017[7]執(zhí)行。

3.1 所有樣品總體情況

對1 034份飼料原料及配合飼料樣品共進行了3 102項次檢測，其中2 501項次檢測結果呈陽性，陽性率為80.63%。在1 034份樣品中，完全沒有檢測出霉菌毒素的樣品僅16份，占總樣品數(shù)的1.55%，僅檢出1種霉菌毒素污染的樣品僅136份，占總樣品量的13.15%；檢出2種霉菌毒素污染的樣品僅281份，占總樣品量的27.18%；檢出3種霉菌毒素污染的樣品有601份，占總樣品量的58.12%（見圖1）。

圖1 2017年飼料及飼料原料中霉菌毒素污染組成

3.2 2017年飼料原料及配合飼料中AFB1污染情況

表1為2017年飼料原料及配合飼料中AFB1檢測結果，樣品中霉菌毒素陽性平均值反映了毒素污染的嚴重程度，意味著引起危害的大小。從試驗結果可以看出，2017年玉米、玉米副產物、小麥及麩皮、粕類和全價料中AFB1檢出率分別為84.57%、93.33%、57.33%、95.38%和100.00%，超標率分別為11.11%、17.78%、1.33%、27.69%和7.65%，其中粕類原料中AFB1超標率最高，達到27.69%。試驗結果顯示，2017年各種飼料和飼料原料中AFB1污染均比較普遍，其中粕類中AFB1污染最為普遍，小麥及麩皮中AFB1污染相對較輕。與周建川等(2017)[8]報道的2016年飼料和原料中AFB1污染趨勢相似。

表1 2017年飼料原料及配合飼料中AFB1檢測結果

3.3 2017年飼料原料及配合飼料中ZEN污染情況

從表2結果可知，本調查結果中各種飼料原料及配合飼料中ZEN的污染均普遍存在，玉米、玉米副產物、小麥及麩皮和全價料中檢出率均在80%以上，其中小麥及麩皮中ZEN檢出率最高，達到92.00%，粕類原料中ZEN檢出率最低，達到58.46%。玉米、玉米副產物、小麥及麩皮、粕類和全價料中ZEN的超標率分別達到2.47%、28.89%、0.00%、6.15%和13.53%，其中玉米副產物中ZEN污染最為嚴重，超標率達到28.89%，主要以玉米皮和DDGS為主。然而，小麥及麩皮中ZEN檢出率最高，但是，ZEN污染的平均值較低，僅為23.91 μg/kg。因此，在玉米副產物的使用上需重點關注，避免玉米副產物中高濃度ZEN污染造成的經(jīng)濟損失。

表2 2017年飼料原料及配合飼料中ZEN檢測結果

3.4 2017年飼料原料及配合飼料中DON污染情況

嘔吐毒素是近年中國飼料原料及配合飼料中出現(xiàn)頻率最高的一種霉菌毒素，已逐漸成為我們關注的飼料和原料霉菌毒素污染的首要指標。表3結果顯示，玉米、玉米副產物、小麥及麩皮、粕類及全價料中DON檢出率分別為96.30%、100.00%、89.33%、81.54%和100.00%，各種飼料原料和全價料中DON污染都非常普遍，其中2017年玉米副產物和全價料中DON檢出率高達100%。同時，超標率結果顯示，小麥及麩皮和玉米副產物中DON超標率最為嚴重，分別達到10.67%和6.67%，是DON污染的高風險飼料原料，其DON最高值分別達到13 347.70 μg/kg和3 949.00 μg/kg。小麥及麩皮和玉米副產物作為飼料原料在全價料中使用時要重點關注。

表3 2017年飼料原料及配合飼料中DON檢測結果

4 討論

由本研究中抽檢的1 034個樣品的AFB1檢測結果發(fā)現(xiàn)，與王若軍（2003）[9]、張丞（2010）[10]以及周建川等（2017）[8]報道的蛋白飼料中霉菌毒素檢測結果相似，粕類原料中AFB1的污染最為嚴重。本研究中粕類原料AFB1陽性樣品檢出率高達95.38%，僅次于全價飼料樣品；粕類原料AFB1超標率高達27.69%，是幾種飼料原料中超標率最高的，其中花生極易受黃曲霉毒素污染[11-12]，黃曲霉毒素污染可發(fā)生在生產、儲藏、加工等各個環(huán)節(jié)，因此花生粕AFB1污染率較高在所難免。粕類原料中AFB1污染平均值為34.51 μg/kg，也與周建川等（2017）[8]報道的2016年粕類原料中AFB1污染平均值34.70 μg/kg接近。

飼料原料及配合飼料中ZEN檢測結果表明，在抽檢的玉米、玉米副產物、小麥及麩皮、粕類及全價料中，玉米副產物中ZEN的檢出率和超標率仍然相對較高。可能的原因是玉米副產物（如玉米蛋白粉、玉米胚芽粕等）很容易受到霉菌毒素的嚴重污染[13]，且DDGS中特定霉菌毒素含量可以達到原谷物中含量的3倍左右[14]，這與周建川等（2017）[8]、王若軍（2003）[9]、張丞等（2010）[10]報道的結果相似。玉米副產物樣品中ZEN平均含量為485.46 μg/kg，超標率為28.89%。周建川等（2017）[8]和張丞（2008，2010）[10，15]也報道玉米副產物DDGS中ZEN含量嚴重超標。

嘔吐毒素抽樣調查結果表明，小麥及麩皮仍然是DON污染最嚴重的飼料原料，玉米副產物次之。玉米副產物和小麥及麩皮中DON超標率分別達到了6.67%和10.67%，DON的平均值分別達到了950.35 μg/kg和1 125.93 μg/kg。其中玉米副產物、小麥及麩皮中DON最高值分別達到了3 949.00 μg/kg和13 347.70 μg/kg，這與周建川等（2017）[8]和敖志剛等（2008）[16]報道的結果相似。

不同國家糧食、飼料和食品中的霉菌毒素限量標準不同。本試驗中霉菌毒素限量標準以2018年5月1日即將實施的新《飼料衛(wèi)生標準》GB13078—2017[7]中規(guī)定的允許限量為準，該標準于2017年10月14日發(fā)布。新的國家標準GB13078—2017[17]中各種霉菌毒素的允許限量都做了較大調整，特別是豬飼料中ZEN的允許限量。舊標準GB13078.2—2006[17]中規(guī)定玉米和配合飼料中ZEN的允許限量應≤500 μg/kg，新標準GB13078—2017[7]規(guī)定仔豬配合飼料≤150 μg/kg、青年母豬配合飼料≤100 μg/kg、其他豬配合飼料≤250 μg/kg。對于飼料企業(yè)而言，新《飼料衛(wèi)生標準》對飼料原料和產品中霉菌毒素的控制要求更加細致嚴格。谷物在生長、收獲、儲存和加工過程中受地域、季節(jié)、氣候等各種非可控因素的影響，污染仍舊普遍，風險依然存在；多種霉菌毒素并存現(xiàn)象，使霉菌毒素的限定標準和風險管理變得更為復雜；且標準中飼料原料和產品中各霉菌毒素限量僅為基礎標準，優(yōu)秀企業(yè)的產品標準要求應遠高于此。所以，我們應高度重視霉菌毒素的潛在風險，嚴格執(zhí)行飼料原料的品控標準，輔以良好的儲存條件，采用科學的解決方案和切實有效的產品，維護畜禽健康，提高生產性能。

5 結論

從以上結果中可以看出，2017年玉米、玉米副產物、小麥及麩皮、粕類及全價料等飼料原料和配合飼料中霉菌毒素污染普遍存在。其中，玉米、玉米副產物DDGS和粕類中AFB1污染仍較嚴重，DDGS和玉米胚芽粕等玉米副產物中ZEN含量也較高，DDGS和小麥副產物中DON污染也相對嚴重，且不同飼料原料和飼料樣品中三種毒素的檢出率都比較高，應注意霉菌毒素間的協(xié)同作用，因此，飼料及養(yǎng)殖業(yè)在使用飼料及原料時，一定要注意霉菌毒素的檢測，做好霉菌毒素的防控工作，并根據(jù)實際情況合理添加霉菌毒素生物降解劑，安全、高效的去除飼料及原料中的霉菌毒素，維護動物健康，提高經(jīng)濟效益。