固態發酵仔豬配合飼料的動力學研究

■管軍軍 張天勇 董 玲 王志祥

（1.河南農業大學畜牧學博士后科研流動站，河南鄭州450002；2.河南廣安生物科技股份有限公司博士后科研工作分站，河南鄭州450001；3.遼寧省農牧業機械研究所有限公司，遼寧沈陽110036）

近年來，一些研究工作者提出利用生物發酵的方法來解決仔豬配合飼料設計與生產中存在的一些問題：纖維素或木質素含量過高，含有抗原性蛋白，添加劑未合理使用等問題[1-2]。篩選一種或幾種益生菌降解飼料中纖維素、抗原蛋白為低聚糖、小肽等營養物質，同時微生物代謝產生各種酶、活性物質有利于仔豬的消化吸收[3-4]。

目前，發酵飼料研究與生產主要以固態發酵為主，從生物反應過程中的本質考慮，固態發酵最顯著的特征就是水分活度低，菌體生長、物質吸收、產物分泌等具有不均勻性，導致體系中物質傳遞具有不連續性，使得發酵過程的各種參數的精確控制比較困難[5]。為解決上述過程控制問題，科研工作者常常從固態發酵動力學上進行研究[6]。當然，不同的固態發酵體系，其動力學的數學模型不同，因此，迄今為止,仍未見到較為完善的有關適用大部分固態發酵過程的數學模型的報道[5]。

對此，本課題組結合固態發酵仔豬配合飼料的產業化實際情況，在前期系統研究前處理工序、單菌種發酵工藝及菌種組合的基礎上，本研究主要集中單菌種(枯草芽孢桿菌、酵母和乳酸菌)及其混菌組合（雙菌種和三菌種）的固態發酵動力學的研究，為固態發酵仔豬配合飼料的過程控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

枯草芽孢桿菌BS-GA15購自潤盈生物工程（上海）有限公司；酵母和乳酸菌為河南工業微生物菌種保藏中心提供；上述各菌種經過篩選馴化后，并加以輔料經冷凍干燥制成發酵劑（＞108CFU/g），冰箱5℃保存備用。仔豬配合飼料551H及552H由河南廣安生物科技股份有限公司生產，其組成如表1所示；另外，葡萄糖等試劑均為分析純，購自鄭州新豐化驗器材有限公司。

1.2 主要儀器設備

SPX-250B智能型生化培養箱，上海瑯玕實驗設備有限公司；JJ-CJ-1FD超凈工作臺，吳江市凈化設備總廠；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；FA2004B電子天平，上海精密科學儀器有限公司。

1.3 粗蛋白的測定

利用凱氏定氮法GB/T6432—1994對仔豬配合飼料或發酵產品進行粗蛋白的測定。

1.4 發酵試驗

將菌種發酵劑接種到培養液[2%（w/v）仔豬配合飼料551H或552H+2%（w/v）葡萄糖+蒸餾水]中，振蕩均勻，置于30℃條件下振蕩培養，轉速為150 r/min，培養4 h。取發酵劑活化液一種（單菌種發酵）或幾種（混菌發酵）接種到固態發酵培養基[仔豬配合飼料551H或552H與蒸餾水(6∶4)組成，裝料100 g/瓶]上，總接種量為5%，混菌發酵各菌種比例利用前期研究的結果[7]選擇最佳配比，具體見表2所示。攪拌均勻后，置于培養箱中30℃固態發酵，一定時間后取樣，50℃條件下干燥成品備用。所有試驗處理均重復3次。

表1 仔豬配合飼料551H及552H配方

表2 混菌發酵最佳菌種配比

1.5 動力學計算

通常，描述生物質變化與時間相互作用的方程有Logistic（邏輯）、指數及線性方程[8]，數學表達為：

式中：X——生物質的濃度，本研究中指蛋白濃度(%)；

X0——0時間點X值(%)；

K——生長率(%/h)；

μ——生長率常數(h-1)；

Xm——承載力(%)。

使用軟件Polymath（6.0版）線性和非線性回歸模塊擬合方程（1）～（3），相關系數R2判斷方程與數據相關性，均方根偏差（Rmsd）評估擬合度。

1.6 統計方法

利用SAS 9.0軟件對試驗結果進行方差分析。

2 結果與討論

2.1 單菌種發酵

圖1 單菌種固態發酵仔豬配合飼料蛋白的變化

單菌種固態發酵仔豬發酵配合飼料過程中，飼料蛋白含量的變化隨著菌種不同而有所不同，而且不同的固態培養基，其結果也不相同(見圖1)，但是發酵時間對于蛋白質含量的影響是非常顯著的(551H：P=0.000 3＜0.01；552H：P＜0.000 1)。具體來說，對于551H(見圖1A)，隨著發酵時間的延長，蛋白含量開始上升，24 h后，酵母與乳酸菌發酵所得產品中蛋白質含量開始下降，而枯草芽孢桿菌則在32 h后則出現下降，40 h后，三種菌發酵的產品蛋白含量均出現小幅上漲；對于552H(見圖1B)，在所研究的發酵時間內，酵母與乳酸菌發酵產品的蛋白含量基本處于上升態勢，而枯草芽孢桿菌呈先升(＜32 h)后降(＞32 h)的態勢。

為了進一步研究各菌種的發酵過程中飼料中蛋白變化態勢，需要從動力學方程進行擬合分析。單菌種固態發酵動力學方程的擬合參數如表3所示。對于枯草芽孢桿菌固態發酵551H或552H，三種動力學方程的擬合結果中R2及Rmsd比較接近，因此這三種動力學方程均可描述該菌種的固態發酵過程，實際應用中線性方程應比較方便；但是，固態發酵552H過程所得擬合方程的R2＜0.8較551H低，因此，模型與實際數據的相關性較551H低，那么所擬合的動力學方程能更好地反應枯草芽孢桿菌對于551H的固態發酵過程。對于酵母或乳酸菌，在固態發酵551H過程中，Logistic方程的R2較大且Rmsd較小，故該動力學方程適合描述這兩種菌種的發酵過程；而552H的固態發酵過程中，針對酵母或乳酸菌所擬合的各動力學方程中R2及Rmsd較為接近，因此，Logistic方程適合描述酵母和乳酸菌對于551H的固態發酵過程，而三種方程均可描述酵母和乳酸菌對于552H固態發酵過程。

表3 單菌種固態發酵仔豬配合飼料動力學方程擬合參數

2.2 雙菌種混菌發酵

對于所研究的雙菌種混菌固態發酵仔豬配合飼料，時間在該發酵過程中，對于產品蛋白的變化仍然影響非常顯著（P＜0.000 1），如圖2所示。具體來說，對于551H的固態發酵過程，蛋白變化基本上處于先升后趨于平緩的態勢（見圖2A）；而于552H的固態發酵過程，12 h內，變化平緩，超過12 h，蛋白變化趨于緩慢上升中(見圖2B)。

圖2 雙菌種固態發酵仔豬配合飼料蛋白的變化

對于試驗結果進行擬合所得動力學數據如表4所示。對于551H，各組合的擬合結果中，Logistic方程R2均在0.9以上，較其它兩種動力學方程大，且Rmsd較小；對于552H，B+L(1∶1)與S+L(1∶1)擬合結果中各方程的R2均在0.9以上且Rmsd較小，而B+S(1∶2)僅Logistic方程的R2在0.9以上；因此，Logistic方程較為適合描述雙菌種固態發酵551H及B+S(1∶2)固態發酵552H過程，而三種動力學方程均適合描述B+L(1∶1)及S+L(1∶1)固態發酵552H過程。

表4 雙菌種固態發酵仔豬配合飼料動力學方程擬合參數

2.3 三菌種發酵

三菌種固態發酵仔豬配合飼料過程中蛋白的變化如同圖3所示，時間仍然是其非常顯著的影響因素（P=0.000 1＜0.01），而且蛋白的變化基本呈上升態勢。經過對試驗結果進行動力學方程擬合可知(表5)，對于551H，三菌種發酵過程所擬合的Logistic與線性方程R2在0.9以上且Rmsd較小；而對于552H，擬合方程R2均在0.9以上且Rmsd較小；因此，Logistic與線性方程可較好地描述三菌種固態發酵551H過程，而三種動力學方程均可較好地描述三菌種固態發酵552H過程。

2.4 討論

動力學方程是生化反應過程中生物質的形成與時間關系的數學描述，從而可通過反應時間控制目標產物生成與變化，一定條件下，有效解決了生化反應復雜性對于產物的影響及在線監控指標等相關應用問題[6]。本研究中，由于飼料中蛋白作為一個主要組成部分，且參與發酵過程，因此，其變化能較好地反應固態發酵過程，所以，用蛋白的變化作為本研究的目標生物質的變化是合理的。通常，描述生物質變化的方程有三種：Logistic、指數及線性方程。按其復雜程度來說，Logistic方程最為復雜，但是能描述生物質的復雜變化，指數方程次之，而線性方程最為簡單，并且應用方便。不論是哪一種方程，只要在一定條件下所擬合的參數與目標產物的變化存在相當高的相關性，擬合度較高，那么，該擬合方程對目標產物的變化與控制就有指導意義。

圖3 三菌種固態發酵仔豬配合飼料蛋白的變化

統計學上，對于擬合方程的評價一般用R2及Rmsd來描述：R2較大且Rmsd較小，則所得方程與數據有很高的相關性與擬合度。R2＞0.7(R＞0.8)，具有較好的相關性；R2＞0.81(R＞0.9)，相關性很高；R2＞0.9(R＞0.95)，相關性非常高；至于R2＜0.7，一般認為相關性不高，不可接受。Rmsd越小，擬合度越高，通常R2較大則Rmsd較小。本次研究中，只有酵母與乳酸菌對于551H的固態發酵過程所擬合的指數與線性方程，R2＜0.7（表3），因此，這兩種微生物固態發酵551H過程不能用指數與線性方程描述。而其它所研究的固態發酵過程所得到的擬合方程R2＞0.7，這三種動力學方程均適用。

表5 三菌種固態發酵仔豬配合飼料動力學方程擬合參數

另一方面，即使在R2＞0.7的情況下，或者對于本研究的所有固態發酵過程（圖1～圖3），發現同一過程的三種動力學方程的擬合結果中，擬合的Logistic方程具有最高的R2及最小的Rmsd（表3～表5），說明Logistic方程雖然復雜，但是非常適合描述固態發酵仔豬配合飼料過程。這也反應出固態發酵仔豬配合飼料是一個相當復雜的過程，若想精確控制該發酵過程，Logistic方程是一個較為合適的方法。

本研究結果是對0～48 h內所得數據的擬合方程，因此，該結果對于相關條件下48 h內固態發酵仔豬配合飼料有較好的指導作用。另外，在控制精度不高的情況下，除酵母與乳酸菌固態發酵551H外，線性方程是一個較好的選擇，能較好地描述大多數固態發酵仔豬配合飼料過程。

3 結論

單菌種(枯草芽孢桿菌、酵母和乳酸菌)及其混菌組合（雙菌種和三菌種）的固態發酵仔豬配合飼料的動力學研究表明：

①發酵時間對于固態發酵仔豬配合飼料的影響非常顯著（P＜0.01）；

②單菌種固態發酵過程動力學：酵母和乳酸菌固態發酵551H過程只能用Logistic方程描述（R2＞0.9），其它發酵過程均可用Logistic方程、指數及線性方程描述（R2＞0.7）；

③混菌固態發酵過程均可用Logistic方程、指數及線性方程描述[雙菌種（R2＞0.7）和三菌種（R2＞0.9）]；

④Logistic方程可以較為精確地描述固態發酵仔豬配合飼料過程[單菌種(R2＞0.7)，混菌(R2＞0.9)]，而線性方程能較好地描述大多數固態發酵仔豬配合飼料過程(R2＞0.7)。

本研究結果將為固態發酵仔豬配合飼料的過程參數與在線控制提供一定的理論支撐與指導。