兒童慢性乙型肝炎患者HBV前C/基本核心啟動子區基因變異特點研究

儲 芳，鐘彥偉，楊紅艷，王 丹，溫夢凡，劉 超，孫群蘭，李 晶，張 明，官卉卉，王文波，張 敏

流行病學數據顯示，我國1～59歲一般人群HBsAg攜帶率為7.18%，5歲以下兒童的HBsAg攜帶率為0.96%。嬰幼兒時期感染者大約85%～95%不能清除病毒轉為慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）， 最終可發展至肝硬化（liver cirrosis, LC）、失代償性肝病甚至肝細胞癌[1-2]。到目前為止，HBV的致病機制尚未完全清楚。國內外研究表明，乙型肝炎（乙肝）患者HBV前C（procore, PC）和基本核心啟動子（basal core promoter, BCP）區變異與乙肝重癥化進程相關[3-5]。但對兒童乙肝患者的研究鮮見報道。本研究探討了兒童CHB患者HBV PC/BCP區變異的特點及臨床特征。

1 對象與方法

1.1 對象 回顧性分析2006年1月—2013年12月在我中心就診的病毒性乙肝患兒166例。年齡1～18歲，其中CHB患兒82例，乙肝相關LC患兒84例。所有病例診斷符合2015年《慢性乙型肝炎防治指南》，患者排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒及HIV感染，酒精，藥物和自身免疫性肝病所導致的肝功能損害。樣本使用標本庫的標本。

1.2 HBV DNA的提取 在1.5 ml塑料離心管中加入200 μl患者血清；然后向上述離心管中加入600 μl病毒DNAout溶液，振蕩30 s混勻后室溫放置10 min；再振蕩30 s混勻，加入700 μl異丙醇，振蕩30 s混勻后，15 000×g室溫離心15 min；移棄上清，加入1.0 ml 70%乙醇，振蕩數秒后，15 000×g室溫離心5 min；移棄上清，加入200 μl超純水，用移液槍仔細吹打離心管管底和管壁的膜狀沉淀，使其溶解。

1.3 血清學標志物及乙肝五項數據 采用患者入院當日采集血液樣本并進行相關臨床檢測的數據。

1.4 HBV PC/BCP區擴增及序列測定 采用巢式PCR方法擴增HBV PC/BCP區序列[6]，PCR反應體系 25 μl。第一輪反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃35 s，59 ℃ 35 s，每2個循環溫度降低2 ℃，72 ℃ 70 s；30個循環。第二輪反應條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 25 s，56 ℃ 25 s，72 ℃ 50 s；35個循環。PCR產物純化后直接測序。使用Vector NTI 軟件對測序結果進行分析。

1.5 統計學處理 用SPSS 19.0對數據進行分析。計量資料首先進行正態性和方差齊性檢驗，當數據符合正態性時，采用x±s表示；方差齊性時，組間比較用t檢驗，當方差不齊時，組間比較采用t’檢驗；當數據不符合正態性時，采用四分位數表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。計數資料采用頻數或率表示；當總樣本量≥40且所有理論頻數均≥5時，組間比較采用χ2檢驗；當總樣本量≥40，但有1≤理論頻數＜5時，組間比較采用連續校正χ2檢驗；當總樣本量＜40，或有理論頻數＜1時，組間比較采用Fisher確切概率法。所有統計分析過程均采取雙側檢驗。 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

166例患兒中，20.83%為感染HBV B基因型的患兒，79.17%為感染HBV C基因型的患兒。

從表1和表2可以看出，在感染B基因型的患兒中，CHB組和乙肝LC組患兒的ALT水平分別為（111.45±100.18）IU/L和（113.42±138.77）IU/L，2組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。但在感染C基因型的患兒中，CHB組和乙肝LC組患兒的ALT水平分別為（123.43±177.32）IU/L和（252.86±275.86）IU/L，2組相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。

在感染HBV B基因型的患兒中，CHB組和乙肝LC組患兒相比，HBV DNA水平差異無統計學意義（P＞0.05），但后者的G1899A位點突變率高于前者（P＜0.05）。在感染HBV C基因型的患兒中，與CHB組患兒相比，乙肝LC組患兒的HBV DNA水平較低但ALT水平較高，差異均具有統計學意義（P均＜0.05）。乙肝LC組患兒發生A1762T、G1764A、G1896A基因位點的突變率明顯高于CHB組患兒（P均＜0.05）。在感染HBV B和C基因型患兒中，CHB組和乙肝LC組患兒相比，基因位點G1752A、T1753C、T1758C、C1766T、T1768A及G1862T的突變率差異均無統計學意義（P均＞0.05）。

表1 B基因型CHB和乙肝LC患兒檢測結果Table 1 Serum examination results of genotype B children with CHB and LC

表2 C基因型CHB 和乙肝LC患兒檢測結果Table 2 Serum examination results of genotype C children with CHB and LC

3 討 論

HBV感染的結果取決于病毒、宿主免疫反應及環境因素之間的關系。當出現特殊的HBV變異打破三者之間的平衡，就會改變病毒與宿主之間的關系，引起肝細胞炎癥，發生嚴重的肝臟疾病。目前，國內外文獻對成人CHB患者HBV變異與乙肝重癥化的相關性研究較多，通常認為HBV基因變異導致的病毒生物學特性改變是影響乙肝患者疾病進展的重要因素之一[7-13]。HBV PC/BCP區變異對HBV的復制和病毒蛋白的翻譯可產生重要影響，進而影響疾病的進展[14-20]。但兒童乙肝患者相關問題的研究報道較少。本研究通過對兒童CHB和乙肝相關LC患者PC/BCP區變異特點及臨床特征的比較，探討二者之間的關系。血清檢測結果顯示：在感染B基因型的患兒中，CHB組與乙肝LC組患兒的ALT水平相比，差異無統計學意義（P＞0.05）。但在感染C基因型的患兒中，CHB組與乙肝LC組患兒的ALT水平相比，差異有統計學意義（P＜0.05）。

HBV PC區最常見的變異通常是1896位點變異，該位點變異可使色氨酸密碼子（TGG）變為終止密碼子（TAG），導致HBeAg合成終止。另外1862和1899位點變異可導致編碼氨基酸改變，從而使HBeAg前體無法被信號酶裂解，對HBeAg的分泌造成影響。HBcAg是細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）識別和攻擊的主要靶抗原。當HBV PC/BCP區變異引起HBeAg缺失時，CTL對肝細胞的攻擊活性增強，從而可引發肝臟免疫性損傷，導致肝臟炎癥病變加劇，疾病重癥化。此外，HBeAg的缺失還可以減弱CTL和Th1的活化誘導性細胞死亡，引起肝細胞大量死亡。HBV變異后往往引起抗原性和致病性改變，它既可使肝病加重，又可使病毒逃避機體免疫而持續感染。也有研究報道HBV BCP變異患者HBeAg表達水平降低，其原因為BCP變異可影響肝臟富集轉錄因子與BCP區的結合，使PC區mRNA轉錄明顯減少，導致HBeAg合成減少[21-22]。最近有研究顯示，T1753C、A1762T、G1764A、C1766T、T1768A、G1862T、G1896A 及 G1899A 位點的突變率隨患者的肝臟炎癥程度呈現上升趨勢，表明這一區域多位點變異發生頻率的增加與疾病重癥化進程密切相關[23]。我們的研究結果顯示感染HBV C基因型患兒，發生A1762T、G1764A、G1896A位點變異者，肝臟炎癥程度呈現上升趨勢，提示這些位點變異可能與乙肝相關LC密切相關。與西方國家乙肝以輸血為主的水平傳播方式不同，我國的CHB患者以母嬰垂直傳播為主，推測PC/BCP區變異可在長期的HBV感染過程中逐步積累，可能參與乙肝的致病機制。本研究結果對于闡明病毒學因素對兒童CHB患者結局的影響有重要意義。HBV感染的結果取決于病毒、宿主免疫反應及環境因素，當HBeAg合成或分泌障礙時，病毒與細胞間的平衡被打破，易引發宿主更強烈的免疫應答，導致更廣泛的肝細胞損傷。本研究結果表明對CHB患兒開展A1762T、G1764A、G1896A位點突變監測具有重要意義。