健康成人腸道病毒71型 VP1和RdRp特異性T細胞免疫應答的初步研究

高 寧，李 梅，李亞萍，王文俊，賈曉黎，黨雙鎖

人腸道病毒71型（enterovirus 71, EV71）能引發手足口病（hand foot and mouth disease,HFMD），以3歲以下嬰幼兒發病為主[1]。成人大多通過隱性感染獲得抗體，感染EV71后很少發病，但可成為傳染源[2]。成人HFMD發病癥狀少見或是輕微與病毒感染后免疫功能較強有關[3-5]。我們前期研究結果顯示EV71感染患兒的外周血T細胞存在結構蛋白VP1和非結構蛋白RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）特異性細胞免疫應答反應[6]。目前有關成人EV71特異性T細胞免疫應答和免疫記憶的研究甚少。本研究通過檢測40例健康成人VP1和RdRp抗原特異性CD4+和CD8+T細胞免疫反應，旨在初步闡述健康成人EV71 VP1和RdRp抗原特異性T細胞免疫反應的特點。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2012年8月于西安交通大學醫學院第二附屬醫院進行健康體檢（均簽署知情同意書）的40例健康成人。其中男19例，女21例，年齡為21～65歲。入選標準：肝、腎功能正常，HBV、HCV血清學指標陰性，既往無過敏史，無自身免疫性疾病、腫瘤、免疫缺陷者，未使用激素和免疫抑制劑，近2周內無任何疾病和不適癥狀，無家族性疾病史及傳染病史。

1.2 儀器與試劑 自動多肽合成機（MBS396，Advanced Chem Tech, Louisville, KY）；超凈化工作臺（蘇州凈化設備公司）；FACSCalibur流式細胞儀（BD公司）；ELISPOT 讀板儀（德國AID公司）；RPMI 1640完全培養液購于美國GIBCO公司；淋巴細胞分離液均購于中國天津灝洋生物制品科技有限責任公司；植物血凝素（phytohemagglutinin, PHA）和胎牛血清購于美國Sigma公司；聚偏氟乙烯膜酶標板購于法國Millipore公司；IFN-γ 酶聯免疫斑點分析法（IFN-γ enzyme-linked immunospot, IFN-γ ELISPOT）檢測試劑盒、堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素均購于瑞典Mabtech公司；堿性磷酸酶顯色劑購于美國Bio-Rad公司；抗-CD4和抗-CD8抗體包被的磁珠，磁力架（Dynabeads; Invitrogen）；FITC Mouse Anti-Human CD8和PE Mouse Anti-Human CD4購于美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 EV71 VP1和RdRp蛋白基因序列重疊肽庫的建立 根據EV71/HubeiChina/2009病毒株（基因號GU434678.1）C4亞型VP1和RdRp蛋白氨基酸基因序列設計。通過生物信息技術設計并合成36條覆蓋VP1蛋白和57條覆蓋RdRp蛋白基因序列重疊多肽，重疊多肽由自動多肽合成機合成，其中每條多肽由15～20個氨基酸組成，相鄰多肽間10個氨基酸重疊。

1.3.2 分離外周血單個核細胞及磁珠分選CD4+、CD8+T細胞 取肝素鈉抗凝新鮮外周靜脈血約20 m1，應用Ficoll密度梯度離心法分離獲得外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。采用陰性磁珠分選法，在PBMCs中分別加入結合磁珠的抗體，吸取獲得不含有CD4+和CD8+T細胞的細胞，同時采用流式細胞方法檢測CD4+、CD8+T細胞的純度達98%以上，且驗證發現 RdRp蛋白特異性T細胞總數與CD4+和CD8+T細胞之和的反應強度無差異。

1.3.3 體外IFN-γ ELISPOT法 包被：終濃度10 μg/ml抗人IFN-γ抗體包被96孔PVDF膜酶標板，4 ℃過夜。加樣：分別加實驗組重疊肽庫5 μl（每條肽段終濃度為 2.5 g/ml）和 100 μl細胞 [（0.5 ～ 10）×105個細胞]，陽性對照組為同一細胞加PHA（終濃度為10 μg/ml）5 μl，陰性對照組為同一細胞加完全1640培養液 5 μl，置于 37 ℃、5%CO2孵箱中過夜（12～18 h）。顯色：加入終濃度為1 μg/ml生物素標記的抗人INF-γ抗體100 μl，室溫放置2 h；洗板，每孔加50 μl堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素（1∶1000），室溫放置1 h，洗板后加50 μl/孔顯色劑，反應孔出現藍色斑點，終止反應。計數：讀反應孔藍色斑點數，每個斑點代表一個特異性T細胞，用斑點形成單位（spot forming units, SFUs）/106PBMCs來表示；設定反應孔內SFUs＞20個，并且＞3倍陰性對照孔SFUs為陽性反應判定標準。反應強度用每106個PBMCs中SFUs數表示；反應頻率用反應陽性例數占全部例數的百分比表示。

2 結 果

2.1 RdRp蛋白肽庫誘導產生T細胞免疫反應 采用體外IFN-γ ELISPOT技術，檢測40例健康成人的EV71 VP1和RdRp蛋白肽庫特異性T細胞產生的IFN-γ反應強度和陽性反應例數（即反應頻率）。結果顯示12例（30%）健康成人檢測到RdRp蛋白肽庫特異性T細胞免疫應答反應，反應強度中位數為64.00 SFUs/106PBMCs；而未檢測到VP1蛋白肽庫特異性T細胞免疫應答（見圖1、2）。

圖1 同一個體對EV71 VP1和RdRp肽段的T細胞反應Figure 1 Comparison of T cell response to EV71 VP1 and RdRp peptides in one adult

2.2 RdRp蛋白特異性CD4+、CD8+T細胞反應 為進一步區分RdRp蛋白特異性CD4+、CD8+T細胞反應，采用磁珠分選法獲取存在RdRp蛋白特異性T細胞免疫反應個體的CD4+T細胞（即去除CD8 T細胞）和CD8+T細胞（即去除CD4 T細胞），再次通過體外IFN-γ ELISPOT技術檢測CD4+和CD8+T細胞反應強度。結果顯示CD4+T細胞參與RdRp蛋白特異性細胞免疫應答（見圖3）。

圖2 EV71 RdRp特異性T細胞應答強度個體分布Figure 2 Distribution of T cell responses specific for EV71 RdRp protein in each subject

圖3 同一個體體外IFN-γ ELISPOT檢測RdRp特異性CD4+ 和CD8+ T細胞反應Figure 3 Ex vivo IFN-γ ELISPOT detection of RdRp specific CD4+ and CD8+ T cell response in one adult

2.3 RdRp蛋白特異性T細胞表位篩選 為找出RdRp蛋白區誘導產生細胞反應的重疊肽段，進行了相應的T細胞表位篩選。將覆蓋RdRp蛋白基因序列的57條重疊肽段分為3組肽庫矩陣，RdRppool 1：RdRp1～18（第1732～1885位氨基酸）；RdRp-pool 2：RdRp19～36（第1886～2029位氨基酸）；RdRp-pool 3：RdRp37～57（第2030～2193位氨基酸），首先利用3組肽庫進行初步篩選，然后對反應陽性的肽庫進行確認實驗，分別用這3組肽庫體外刺激已知12例存在RdRp蛋白特異性T細胞免疫應答陽性的個體，發現均可檢測到一組或更多組RdRp肽庫特異性T細胞反應，表明RdRp蛋白具有多個T細胞表位，不同個體識別表位可能與其人類白細胞抗原表型差別有關（見表1）。

表1 EV71 RdRp肽庫中含有的T 細胞表位Table 1 EV71 RdRp peptides containing T cell epitope

3 討 論

本研究選取EV71 VP1和RdRp作為研究靶蛋白，其中VP1是EV71中和決定子，直接決定病毒的抗原性[7-8]；RdRp高度保守是病毒復制的關鍵酶[9-10]。既往動物實驗表明，編碼VP1的DNA疫苗能誘導特異性T細胞免疫反應[11]。我們前期研究也顯示VP1和RdRp均可誘導EV71感染患兒T細胞免疫應答反應[6]。成人感染EV71后發病非常少見，往往作為病毒攜帶者和傳染源[12]。臺灣一項關于家庭內密切接觸傳染的前瞻性隊列研究發現，每個HFMD患兒家庭中至少有一個成員有EV71感染，所有成員中52%感染EV71，其中成人為38%[13]。對EV71完全具有免疫力的成人也有超過16%沒有抗EV71中和抗體[14]，細胞免疫反應在疾病發生發展中起重要作用。而在對EV71隱性感染者，特別是對健康成人中EV71特異性T細胞免疫反應的研究尚為空白。

本研究選取40例健康成人作為研究對象，通過重疊肽技術合成覆蓋EV71 C4亞型結構蛋白VP1和非結構蛋白RdRp重疊肽段作為抗原，采用IFN-γ ELISPOT和磁珠分選法進行檢測，結果顯示有12例（30%）健康成人檢測到RdRp蛋白特異性T細胞反應，RdRp蛋白誘導的T細胞免疫應答以特異性CD4+T細胞為主；而未檢測到VP1特異性T細胞免疫應答。健康成人外周血檢測到EV71 RdRp蛋白特異性T細胞免疫反應，提示這部分健康成人為EV71隱性感染或是既往感染后機體保留的免疫記憶，但是維持多久有待進一步研究。

本研究中還鑒定了9個EV71 RdRp蛋白的T細胞表位。這些單個重疊肽段同時可以誘導產生CD4+T細胞免疫應答，說明CD4+T細胞能夠識別RdRp抗原表位。本實驗對健康成人外周血VP1和RdRp蛋白存在特異性T細胞免疫應答的初步探討提示：①RdRp特異性T細胞免疫應答在健康成人個體中存在陽性反應，但未檢測到VP1特異性T細胞免疫應答；②健康成人RdRp特異性T細胞免疫應答以CD4+T細胞免疫應答為主；③健康成人外周血存在特異性CD4+T細胞，可能存在EV71隱性感染或與其他腸道病毒存在交叉抗原表位；④健康成人外周血中可能存在RdRp蛋白肽庫特異性記憶T細胞，并在體內長期維持記憶功能。該研究有助于指導控制EV71的流行，闡明EV71的細胞免疫應答機制，為EV71感染防控提供重要的理論依據。

志謝感謝英國牛津大學分子醫學研究所人類免疫中心Tao Dong教授對本實驗給予的指導