束縛應激致福利損傷小鼠肝臟中鈣調蛋白的表達*

馬 暢 趙迎峰 梁 磊 尤金煒 董 敏 惲時鋒

（1.南京軍區南京總醫院比較醫學科，全軍實驗動物科普與倫理教育基地，全國科普教育基地，南京 210002）（2.南京軍區南京總醫院干部保健科，南京 210002）

實驗動物是生命科學研究和發展的重要支撐條件，其福利水平對科學研究有著重要的影響。福利受損使實驗動物不能實現康樂狀態（well-being）[1]，其生存質量下降、機體各系統紊亂，這將會降低研究結果的可靠性[2-3]。束縛應激導致的生理變化是一個復雜的生理調控過程，最終導致體外表征的出現，這一過程必然是由多種調控蛋白參與其中。鈣調素（calmodulin，CaM）是一種多功能調節蛋白，廣泛表達于多種真核細胞中，作為 Ca2+的受體蛋白，其對多種細胞內Ca2+依賴的細胞功能和酶系統都有重要的調節作用[4]。本研究采用動物實驗中常用的ICR小鼠，通過束縛應激以降低其福利水平，觀測其肝組織中CaM表達水平的變化，探尋實驗動物福利與CaM之間的聯系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與飼育環境

SPF級雄性 ICR小鼠20只，3周齡，18～19 g，由南京總醫院比較醫學科提供 SCXK（軍）2012-0014，實驗動物使用許可證號為 SYXK（軍）2012-0047。全價顆粒飼料由江蘇協同醫藥生物工程有限責任公司提供。

1.2 實驗分組和慢性束縛應激模型建立

20只ICR小鼠隨機挑選并分組：對照組（n=10）：常規飼養；束縛組（n=10）：參照文獻[5]，使小鼠保定于束縛器內（限制其自由活動，但無壓迫感），實驗期每日8：00、15：00 開始，每次束縛 1 h，期間禁食禁水，干預期一周。

1.3 試劑及儀器

RIPA蛋白裂解液（碧云天），一抗 CaM antibody、CaMKⅡantibody、GAPDH antibody（Santa Cruze），二抗山羊抗兔-HRP、山羊抗小鼠-HRP（Santa Cruze），Protein Marker、BCA Protein Assay Kit（Takara），Acr、Bis、Tris（Sigma），ELISA試劑盒（Ray Biotech）。 垂直電泳系統、酶標儀（Bio-red），5200 全自動化學發光圖像分析系統（Tannon），7600全自動生化分析儀（日立）。

1.4 樣本采集與指標測定

1.4.1 記錄小鼠的初始、終末體質量和實驗期間進食量，計算體增重和飼料能效比。

1.4.2 實驗期結束，小鼠經眼眶靜脈叢收集血液樣品，室溫下靜置 1 h，5 000 r/m in離心 15 m in，分離血清，-40℃冰箱保存。ELISA試劑盒檢測皮質酮和促腎上腺皮質激素水平，全自動生化分析儀檢測主要肝功能指標谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶和堿性磷酸酶。

1.4.3 Western blot檢測CaM、CaMKⅡ蛋白表達水平：取各組小鼠肝臟組織約100 mg，加預冷的RIPA蛋白裂解液1 m L，冰浴勻漿，13 000 r/min低溫離心，BCA Protein Assay Kit測定上清液的總蛋白濃度。各組蛋白上樣量為40μg，經10%SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉印至NC膜，PBST配制10%脫脂牛奶用于封閉，適當比例稀釋的 CaM、CaMKⅡ和GAPDH一抗4℃孵育過夜，PBST洗膜，相應二抗37℃孵育30 min，洗膜后用化學發光試劑盒顯影，應用Tannon化學發光圖像分析儀拍照分析，每組樣本進行3次重復。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 體增重與飼料能效比

見表1。經過為期一周的束縛應激后，束縛組小鼠體增重較對照組顯著減少（P＜0.01），飼料能效比顯著降低（P＜0.01）。

表1 體增重與飼料能效比（±s±s，n=10）Tab le 1 Body weight gain and food efficiency ratio（±s±s，n=10）

表1 體增重與飼料能效比（±s±s，n=10）Tab le 1 Body weight gain and food efficiency ratio（±s±s，n=10）

注：與對照組比較，**P＜0.01Note： Compare with untreated group， **P＜0.01.

對照組10.10±1.45 20.37±1.88束縛組 6.06±1.87** 14.86±3.73**

2.2 免疫功能和神經內分泌指標

見表2。束縛應激后小鼠的脾臟和胸腺的臟器指數較對照組均顯著降低（P＜0.01，P＜0.05），而血清中的皮質酮和促腎上腺皮質激素水平均顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。

表2 免疫學指標與血清 CORT、ACTH的測定結果（±s±s，n=10）Tab le 2 Results ofm easurem en ts of imm unological index， serum levels of CORT and ACTH（±s ±s，n=10）

表2 免疫學指標與血清 CORT、ACTH的測定結果（±s±s，n=10）Tab le 2 Results ofm easurem en ts of imm unological index， serum levels of CORT and ACTH（±s ±s，n=10）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01Note：Compare with untreated group，*P＜0.05，**P＜0.01

0.6628±0.1006 0.2703±0.0415 68.95±8.14 7.61±1.07束縛組 0.5097±0.1198** 0.2514±0.0212* 106.96±9.38** 8.34±1.15對照組*

2.3 主要肝功能指標

見表3。束縛應激后小鼠的主要肝功能指標谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶和堿性磷酸酶水平較對照組顯著升高（P＜0.05）。

表3 主要肝功能測定結果（±s±s，n=10）Tab le 3 Results ofm easu rem en ts of liver function tests（±s±s，n=10）

表3 主要肝功能測定結果（±s±s，n=10）Tab le 3 Results ofm easu rem en ts of liver function tests（±s±s，n=10）

注：與對照組比較，*P＜0.05Note： Compare with untreated group， *P＜0.05

組別 谷草轉氨酶AST/（U/L）谷丙轉氨酶ALT/（U/L）堿性磷酸酶ALP/（IU/L）127.23±29.89 72.52±16.39 112.31±22.78束縛組 161.66±32.87*106.44±24.11* 145.39±25.91對照組*

2.4 CaM、CaM KⅡ蛋白表達

與對照相比，束縛組小鼠肝臟中CaM和CaMKⅡ相對表達水平均顯著上升（P＜0.05），如圖1。

3 討論

圖1 各組小鼠肝臟CaM、CaM KⅡ蛋白表達Fig.1 Relative exp ression of CaM、CaM KⅡin liver of different groups

科研工作中各種操作給實驗動物帶來的心理和生理痛苦是常見的福利傷害[6]，正確評估并加以改善福利傷害是動物福利的主要研究方向。束縛應激是目前常用的一種引發身心壓力造成福利損害的實驗方法[7]。本實驗選取較為公認的動物福利評價指標[8]，綜合評價束縛應激對小鼠福利的傷害情況。本實驗中生長指標顯示，束縛應激后小鼠的體增重和FER均顯著下降，提示束縛應激使小鼠生長速度減緩。有研究報道，實驗操作能使小鼠免疫器官退化，導致免疫抑制[9]，本實驗也得到相同結論，主要免疫器官臟器指數結果顯示，束縛組的胸腺指數和脾臟指數明顯降低，說明束縛應激可影響小鼠的免疫器官。據以往報道，機體受應激刺激后以下丘腦-垂體-腎上腺通路（HPA）激活為主要特征，而HPA終末產物皮質酮和促腎上腺皮質激素水平上調是其激活的主要表現[10]。本研究的結果表明，束縛組外周血清的皮質酮和促腎上腺皮質激素水平明顯升高，表明應激小鼠 HPA軸的激活，改變了其體內相關神經內分泌系統活性。綜上指標，我們可以認為束縛組小鼠已經福利受損。

肝臟作為一種重要的代謝器官，應激會影響肝臟疾病的發生、發展和結果。有研究報道情緒應激能顯著增大肝臟的血流量[11]。另有研究表明，酒精性肝炎患者的心理應激水平和肝纖維化程度密切相關[12]。Kunkel等研究發現，慢性乙型病毒性肝炎患者血清ALT水平與心理抑郁程度之間有顯著的正相關系[13]。在動物模型研究中，應激和肝病之間的密切關系也已得到證實。Iwai等[14]報道電擊應激可以加重用四氯化碳處理過的小鼠肝臟損害。而在正常的嚙齒類動物中，束縛或電擊應激可導致輕度肝損傷，其特點是血清中 ALT水平輕度升高[15-16]。本研究結果顯示，束縛應激組小鼠的 AST、ALT和ALP三項肝功能指標均顯著升高，表明束縛應激致福利損傷小鼠的肝功能已經受到損害，而且持續慢性應激可以維持這種損傷程度，正如Zhu等[17]的研究結果，慢性束縛應激損害了肝臟的功能。

束縛應激導致的生理變化是一個復雜的生理調控過程，最終導致體外表征的出現，例如當福利水平下降時，動物往往表現出毛色不順、攝食減少、免疫抑制、代謝及內分泌紊亂等一系列問題，這一過程必然是由多種調控蛋白/因子參與其中。本實驗室前期研究結果表明，制動使SD大鼠福利受損時，其肝臟中核因子-κB的蛋白和基因水平均顯著升高，預示著核因子-κB的變化參與了福利損傷及機體功能紊亂的調控[18]。在真核生物中，CaM作為胞質溶膠蛋白可調節多種Ca2+依賴的功能和酶活性。Ca2+-CaM信號在許多病理生理過程中起著重要的作用。鈣-鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）為廣泛分布的多功能蛋白激酶，參與多種生理和病理信號轉導，也是影響胞內代謝調節的最重要因素之一[19-20]。為了進一步探究機體內參與應激致福利損傷的信號分子通路，本研究對肝臟組織CaM和CaMKⅡ的蛋白表達水平進行了檢測，結果顯示束縛應激條件下的這兩種蛋白水平均顯著升高，因此我們推測束縛應激至機體產生終末代謝物的這一個過程，CaM及其相關調節蛋白參與其中，但 CaM和CaMKⅡ在這一過程中的具體調節機制還不明確，需要我們進一步探索。