探討-20℃凍存條件下分裝凍融對SD大鼠血清生化檢測結果的影響

孫昌華 劉 娜 王春芳 張 娟 祝清芬

（山東省食品藥品檢驗研究院，濟南 250101）

在毒理學研究中，臨床病理學是非常重要的一個分支學科。它是一門將臨床醫學和實驗技術相結合，在實驗室內通過對各種項目的檢驗，為藥物毒性的評價提供重要依據的學科[1]。臨床檢驗的目的是為臨床提供準確可靠的實驗診斷依據。為了保證實驗數據的可靠性，在檢驗醫學中必須堅持全面質量控制（total quality control TQC，即指對影響臨床檢驗結果可靠性的各方面因素及各個環節進行質量控制）和全過程質量控制（即指對實驗工作的全過程進行質量控制和質量管理）。全過程質量控制包括實驗前（分析前）、實驗中（分析中）和實驗后（分析后）三個階段的質量控制。在實驗誤差中實驗前誤差占70%，因而實驗前質量保證對減少實驗誤差顯得尤其重要[2]。

待檢測的血液標本的保存是臨床醫學檢驗分析過程中，對其質量進行有效控制的一個重要組成部分[3]，血液標本的具體放置時間及方式，對檢測得到的生化指標具體值所產生的影響及其原因是目前臨床醫學界所關注和探討的一個焦點性課題[4-6]。資料顯示，由于檢驗前對標本處理不當造成的檢驗誤差占總的檢驗誤差的60%以上[7-9]。文獻報道，血液標本的保存方式對生化項目的檢測結果具有重要影響[10-11]。在檢驗臨床和科研工作中，經常要對血清標本進行凍存，以備日后檢測或復查。“血清分裝凍融檢測會影響結果”似乎已成為共識。問題是影響程度有多大？導致結果升高還是降低？本文通過血清標本分裝凍融對相關生化檢測結果的影響，初步探索了血清檢測過程中的各項指標的變化特點，為檢驗者提供最佳的檢測時間提供參考，用科學的數據來說明標本前處理對檢驗結果準確性影響的重要性。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

7180全自動生化分析儀（日本日立）；臺式低速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；海信BCD-227uk電冰箱（海信集團）

1.2 試劑及耗材

血清生化促凝管（山東奧塞特醫療器械有限公司）；一次性使用血樣采集針（山東奧塞特醫療器械有限公司）；4.5%戊巴比托納（Sigma公司）；生化復合校準品（CFAS），生化質控物 Level 1（AMCC），生化質控物 Level 2（AMCC），ALT、AST、TP、ALB、GLU、UREA、CREA、TC、TG試劑盒（四川邁克生物科技股份有限公司）

1.3 實驗動物

SD大鼠，SPF級，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產許可證號 SCXK（魯）20140007，雌性 SD大鼠40只，體質量280～330 g。

1.4 采集、離心

動物麻醉后，腹主動脈采集空白組SD大鼠血液，每只動物采集1管，每管約6～8 m L，編號標識，血液2～8℃靜止30 min后離心，血清分裝并用封口膜封口，每只動物分裝4份。

1.5 方法

1.5.1 儀器校準及質量控制：儀器校準、質控按照本實驗室的儀器標準操作規程進行。儀器開機后使用復合校準品分別對 ALT、AST、TP、ALB、GLU、UREA、CREA、TC、TG九項生化指標進行校準，待校準結束后進行復合質控品的檢測。質控結果均在質控物靶值范圍內方可進行檢測。血清首次檢測（室溫4 h）應對儀器待檢測項目進行校準，之后-20℃凍存各保存時間（2 d、7 d、14 d）如質控結果均在質控物靶值范圍內時儀器則不進行校準。各保存時間（2 d、7 d、14 d）的每次檢測均于檢測前、檢測后進行2次復合質控品的檢測。

1.5.2 血清分組和凍融方式：血清標本離心，分裝后用封口膜封口，每只動物分裝4份。室溫4 h完成第一份血清的檢測，結果作為基準參考水平。其余三份血清放置于-20℃凍存，分別于保存時間的2 d、7 d、14 d各取一份進行檢測。融化方式為直接將冷凍的血清標本取出后放置室溫2 h左右以保證完全融化。

1.5.3 血清檢測：室溫4 h完成第一次檢測，結果作為基準參考水平。 -20℃凍存的血清分別于保存時間的2 d、7 d、14 d各取一份進行檢測，每次檢測完畢后檢測血清無需經害化處理。比較室溫4 h與-20℃凍存各保存時間內生化檢測結果的影響。

1.5.4 檢測方法：檢測操作按照生化分析儀操作規程及試劑盒說明書進行，保證所有標本在同一環境條件下、由同一人同時進行檢測。

1.6 統計方法

2 結果

2.1 凍存時間對血清外觀的影響

血清在保存過程中顏色、渾濁度和其他物理性狀，從肉眼觀察未見明顯變化，-20℃凍存條件下各保存時間內不同處理組之間未見明顯區別。

2.2 凍存時間對血清檢測結果的影響

見表1。

表1 不同保存條件下各項生化指標檢測結果（±s±s，n=40）Table 1 Test results of various biochem ical indicators under differen t storage conditions（±s ±s，n=40）

表1 不同保存條件下各項生化指標檢測結果（±s±s，n=40）Table 1 Test results of various biochem ical indicators under differen t storage conditions（±s ±s，n=40）

注：*P＜0.05與室溫4 h比較Note：*P＜0.05 compared with Room temperature 4 h

ALT/（U/L） 22±3 20±4* 19±3*21±4 AST/（U/L） 158±34 155±40 139±35 157±37 TP/（g/L） 55.0±2.8 50.4±4.6*48.5±4.6* 51.8±5.4*ALB/（g/L） 33.7±1.5 30.8±2.3*29.5±2.6* 31.3±2.9*GLU/（mmol/L） 7.2±0.7 6.2±1.0*6.1±0.7* 6.3±1.1*UREA/（mmol/L） 6.1±1.1 5.7±0.9 5.5±0.9* 5.7±0.9 CREA/（μmol/L） 26±4 24±3* 21±3* 23±4*TC/（mmol/L） 1.47±0.34 1.35±0.36 1.28±0.34*1.36±0.34 TG/（mmol/L）0.45±0.10 0.42±0.10 0.41±0.12 0.44±0.12

3 討論

藥物毒理學安全性評價的目的是為了確保人用藥物的安全。血液是藥物作用最常見、最敏感、最大的靶器官，某些藥物直接或間接作用于血液及造血系統，造成可逆或不可逆性的各種復雜的損傷[12]。2006年我們國家首部規范臨床實驗室管理的國家級法規《臨床實驗室管理辦法》出臺，標志我們國家臨床實驗室的管理已經進入了新的階段，臨床實驗室對ISO15189的國際公認的實驗室認可和認證的管理需要，都促使臨床實驗室檢測結果的質量問題日益成為人們關注的熱點問題。實驗室的質量控制主要分為分析前、分析中、分析后，大量的實驗表明[8-9]，臨床實驗室的質量問題超過60%以上來源于分析前，因此，分析前因素的控制就成為實驗室檢測結果準確性的重要保證，而標本的正確處理又是分析前因素中最為重要的因素之一[7]。

SD大鼠血清標本-20℃凍存條件下分裝凍融檢測結果分析可見，分裝凍融14 d血清生化檢測結果與室溫4 h比較TP、ALB、GLU、CREA可見統計學差異（P＜0.05）；分裝凍融7 d血清生化檢測結果與室溫 4 h 比較 ALT、TP、ALB、GLU、UREA、CREA、TC可見統計學差異（P＜0.05）；分裝凍融2 d血清生化檢測結果與室溫4 h比較 ALT、TP、ALB、GLU、CREA可見統計學差異（P＜0.05）；分裝凍融2 d、7 d、14 d血清生化檢測結果與室溫4 h比較 AST、TG均未見統計學差異（P＞0.05）。本研究結果表明，SD大鼠血清標本 -20℃分裝凍融條件下2 d、7 d與室溫 4 h比較，7項生化檢測項目 ALT、TP、ALB、GLU、UREA、CREA、TC檢測結果數據呈現降低趨勢且檢測結果具有統計學差異，分析其原因主要是由于在融凍過程中一些檢測指標被破壞，即所謂的“冷變性”，造成了凍融后檢測結果的偏低，與文獻報道結果一致[13-14]。 -20℃分裝凍融條件下14 d與 2 d、7 d比較，7項生化檢測項目 ALT、AST、TP、ALB、GLU、TC、TG檢測結果數據呈現升高趨勢且部分檢測結果具有統計學差異，綜合分析其原因，盡管采取標本封蓋、封口膜封口，防止血清標本蒸發等措施，因凍存時間的延長，最終還是影響檢測結果，此結果與文獻報道一致，隨著保存時間的延長致使血清中水分蒸發加大，血清濃縮，其成分含量相對增加，檢驗結果升高[5-6，11，15-16]。 本次研究可見，-20℃分裝凍融2 d、7 d、14 d血清生化檢測結果與室溫4 h比較AST、TG結果穩定均未見統計學差異，此結果與文獻報道一致[6，17-19]。

研究顯示，生化檢測項目應盡早檢測，盡量降低影響因素[6，11，15，20-21]。 所以，很多血液標本需要在采集后3～4 h內才能得到準確的結果[22]。研究表明，22～25℃血清或血漿的保存不超過8 h；8 h內不能完成時，血清或血漿應置于2～8℃保存；48 h內不能完成的實驗項目，或分離的血清或血漿需儲存48 h以上時，應于-20℃保存[2]；如需長時間保存后檢測，最好選擇-80℃冰箱進行保存，且以2個月保存期限檢測結果較好[23]，選擇 -80℃要比-20℃更加穩定[24-26]。相關文獻資料報道，標本的保存時間與保存溫度有關，22～24℃保存2 h，2～4℃保存4 h，-20℃保存2周，-80℃保存6個月[27]。本研究結果表明，-20℃分裝凍融條件下SD大鼠血清標本對生化檢測結果影響明顯，分裝凍融2 d、7 d因相關酶所謂的“冷變性”檢測結果呈現降低趨勢；分裝凍融14 d隨著保存時間的延長，致使血清中水分蒸發加大，血清濃縮，檢驗結果升高；AST、TG在 -20℃分裝凍融 2 d、7 d、14 d內檢測結果與室溫4 h比較，數據穩定，未見明顯影響。

綜上所述，待測血清的保存方式及時間對生化項目檢測結果具有重要影響，臨床應給予高度重視，并根據各檢測指示的差異，采取相應的保存措施，才能確保保存后的標本結果具有真實性和可靠性。