5-aza-2dC對乳腺癌細胞增殖及PRDM2和PRDM5甲基化的影響

白 杰,張曉宇,康曉寧,靳麗君,張 勤，邵建強，王遵義

乳腺癌是一種多發于女性乳腺組織的常見惡性腫瘤，發病率逐年增高且趨于年輕化，臨床上以乳腺浸潤性導管癌發生率較高[1]。相關研究表明，抑癌基因啟動子區異常甲基化，可導致基因沉默，促進腫瘤發生、發展[2]。5-氮 -2'脫氧胞苷（5-aza-2dC）是一種DNA甲基轉移酶抑制劑，可逆轉DNA甲基化狀態[3]。多種腫瘤組織中，PR區鋅指蛋白（PRDM）基因啟動子區甲基化水平異常升高，呈低表達[4]。本研究通過觀察5-aza-2dC對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響及對細胞中PRDM2和PRDM5甲基化水平的影響，探討PRDM2和PRDM5甲基化狀態在乳腺癌細胞增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設備 人乳腺癌細胞株MDAMB-231（中國科學院上海細胞庫）。5-aza-2dC、DMEM培養基、胎牛血清、鏈霉素、二甲亞砜、青霉素（美國Sigma公司）；MTT試劑盒、96孔細胞板、24孔板（碧云天公司）；EZ-DNA甲基化修飾試劑盒（美國ZymoResearch 公司）；Taq DNA Polymerase（南京vazyme公司）；蛋白提取試劑盒、胰蛋白酶、BCA試劑盒（日本Takara公司）；抗體（美國 CST公司）；MSP引物（上海生工合成）。CO2培養箱（日本sanyo公司）；Elx800酶標儀（美國BioTek公司）；普通光學顯微鏡（美國Olympus公司）；S1000梯度PCR儀、電泳儀、核酸成像分析儀（美國BioRad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理 復蘇人乳腺癌MDAMB-231細胞，轉入DMEM培養基（加入15%胎牛血清），加入青霉素（100 U/ml）、鏈霉素（100 μg/ml），置于 CO2培養箱（5%CO2，37℃）中培養，收集進入對數生長期的細胞進行實驗。采用0.25%胰蛋白酶消化細胞，接種于 40 mm 細胞培養皿（1×106個/板），24 h 后，分別加入終濃度為 0（對照組）、1、2.5、5、10 μmol/L的5-aza-2dC處理細胞，每個濃度設置4個復孔。每24 h更換一次含不同濃度5-aza-2dC的新鮮培養基。

1.2.2 偶氮唑藍（MTT）法檢測細胞增殖情況 不同濃度 5-aza-2dC 作用 1、2、3、4、5 d 后， 收集細胞，嚴格按照MTT試劑盒說明書進行操作，使用全自動酶標儀檢測570 nm波長下各孔細胞吸光度值（OD）。每個濃度每個時間點設置4個復孔，實驗重復3次。

1.2.3 甲基化特異性 PCR（MSP）檢測PRDM2和PRDM5甲基化水平 不同濃度5-aza-2dC處理后5 d，收集細胞，加入Trizol試劑，提取細胞總RNA，檢測其濃度和質量，反轉錄合成cDNA。采用EZ-DNA甲基化修飾試劑盒，對1 μg DNA進行亞硫酸氫鹽修飾，采用PRDM2和PRDM5甲基化引物和非甲基化引物(表 1)進行擴增，反應體系 25 μl：2×TaqMasterMix 12.5 μl、DNA 模板（100 ng/μL）2 μl、正反向引物（10 μmol/L）各 0.5 μl、DNase-free H2O 10.5 μl。MSP 反應條件：95 ℃預變性 5 min；95 ℃ 30 s，59℃ 35 s，72 ℃ 35 s，35個循環；72 ℃延伸 10 min；4℃保存。取出PCR產物，置于2%瓊脂糖凝膠中電泳（220 v，28 min），采用凝膠成像系統采集圖像并分析。

表1 PRDM2和PRDM5MSP引物序列

1.2.4 實時定量 PCR（qRT-PCR）檢測 PRDM2和RPremix Ex TaqTM Ⅱ（RNaseH Plus）試劑盒說明書進行。采用2-△△CT對qRT-PCR結果進行分析。PRDM2和PRDM5及內參基因GAPDH qRTPCR引物由上海生工合成，具體序列見表2。PRDM5 mRNA水平 以“1.2.2”中合成的cDNA為模板，檢測PRDM2和PRDM5 mRNA水平，操作按照SYBR

表2 PRDM2和PRDM5及GAPDHqRT-PCR引物

1.2.5 蛋白免疫印跡（WB）法檢測PRDM2和PRDM5蛋白水平 參照“1.2.2”中方法收集各組細胞，提取總蛋白，BCA蛋白試劑盒測定總蛋白含量。以GAPDH蛋白為內參，檢測PRDM2和PRDM5蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法 應用SPSS 21.0軟件進行統計學分析,計量資料以均數±標準差表示，兩兩比較行t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5-aza-2dC抑制MDA-MB-231細胞增殖 與對照組比較，5 μmol/L 和 10 μmol/L 的 5-aza-2dC 作用 1、2、3、4 d 后，MDA-MB-231 細胞增殖能力明顯被抑制(P＜0.05)；各濃度5-aza-2dC作用5 d后，細胞細胞增殖能力均明顯被抑制(P＜0.05)，且隨著5-aza-2dC濃度的增加，對細胞增殖的抑制作用逐漸增強（表3）。后續實驗均采用5-aza-2dC作用5 d。

表3 5-aza-2dC對MDA-MB-231細胞增殖的影響

2.2 5-aza-2dC降低MDA-MB-231細胞中PRDM2和PRDM5甲基化水平 與對照組比較，各濃度5-aza-2dC作用 5 d后，細胞中 PRDM2（圖 1A）和PRDM5（圖1B）甲基化水平均顯著降低。5 μmol/L和10 μmol/L的5-aza-2dC作用5 d后，細胞中PRDM2和PRDM5甲基化狀態呈現陰性。

2.3 5-aza-2dC促進MDA-MB-231細胞中PRDM2和PRDM5 mRNA表達 與對照組比較，各濃度5-aza-2dC作用 5 d后，MDA-MB-231細胞中 PRDM2和PRDM5蛋白水平均顯著增加（表4）。

表4 5-aza-2dC對MDA-MB-231細胞中PRDM2和PRDM5mRNA表達的影響

圖1 5-aza-2dC對MDA-MB-231細胞PRDM2和PRDM5甲基化水平的影響

2.4 5-aza-2dC促進MDA-MB-231細胞中PRDM2和PRDM5蛋白表達 與對照組比較，各濃度5-aza-2dC作用5 d后，MDA-MB-231細胞中PRDM2和PRDM5蛋白水平均顯著增加(圖2)。

3 討論

近年來，術后轉移和復發仍然是導致乳腺癌治療失敗、發生死亡的重要原因[5]。因此，預防乳腺癌轉移具有重要臨床意義。DNA甲基轉移酶抑制劑可特異性地抑制DNA甲基轉移酶的活性，降低DNA甲基化水平，促進基因表達[6]。Dong等[7]發現，5-aza-2dC可通過促進TFPI-2基因的表達，抑制非小細胞癌A549細胞株增殖能力。本研究發現，5-aza-2dC作用后，人乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖能力顯著下降，且在一定范圍內，隨著5-aza-2dC濃度和作用時間的增加，對細胞增殖的抑制作用逐漸增強，表現出一定的濃度依賴效應和時間依賴效應。

圖2 5-aza-2dC對MDA-MB-231細胞PRDM2和PRDM5蛋白表達的影響

PRDM屬于鋅指蛋白大家族，包含N-端PR結構域和C端鋅指結構域[8]。研究表明，PRDM2和PRDM5具有組蛋白甲基轉移酶活性，可通過與其他蛋白協同直接作用于靶基因或間接修飾染色體等參與調節基因轉錄，調控細胞生長[9]。Zazzo等[10]發現，PRDM2在睪丸生殖細胞腫瘤中低表達。Shu等[11]研究證實，過表達PRDM5可顯著抑制腫瘤細胞增殖能力。以上研究結果提示，PRDM基因異常甲基化可能引起其表達水平降低，抑癌作用減弱，導致腫瘤發生。Minkovsky等[12]發現，5-aza-2dC可通過抑制DNA甲基轉移酶活性，促進DNA去甲基化作用，進而抑制骨髓系白血病細胞株中DNA甲基化水平，抑制腫瘤細胞生長，促進細胞凋亡。本研究發現，5-aza-2dC處理可顯著降低MDA-MB-231細胞中PRDM2和PRDM5甲基化水平，且具有濃度依賴性，但5、10 μmol/L5-aza-2dC作用5 d后，細胞中PRDM2和PRDM5甲基化水平無明顯差異，提示5 μmol/L5-aza-2dC即可有效逆轉MDA-MB-231細胞中PRDM2和PRDM5異常甲基化狀態。進一步分析發現，5-aza-2dC處理后，MDA-MB-231細胞中PRDM2和PRDM5mRNA和蛋白相對表達水平顯著升高，提示5-aza-2dC可能通過逆轉PRDM2和PRDM5異常甲基化狀態，恢復PRDM2和PRDM5基因表達，促進蛋白表達，從而抑制乳腺癌細胞增殖。

綜上所述，5-aza-2dC可降低乳腺癌MDA-MB-231細胞中PRDM2和PRDM5甲基化水平，促進抑癌基因PRDM2和PRDM5表達，抑制乳腺癌細胞增殖。表明PRDM2和PRDM5基因有望作為防治乳腺癌轉移的有效生物靶標，為尋找可降低乳腺癌細胞DNA甲基化程度的特異性藥物提供生物靶點。