LPS介導(dǎo)TLR4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)小鼠成骨細(xì)胞活性和凋亡的影響

徐 頔，劉永光

細(xì)菌脂多糖（LPS）系革蘭陰性厭氧菌內(nèi)毒素重要構(gòu)成部分。早期研究發(fā)現(xiàn)，慢性根尖周炎與牙周炎時(shí)，LPS可刺激細(xì)胞釋放炎性因子，促進(jìn)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為破骨細(xì)胞前體，促進(jìn)成熟破骨細(xì)胞存活，影響骨吸收、骨沉積平衡，引起骨喪失[1]。也有研究發(fā)現(xiàn)，LPS可直接作用于成骨細(xì)胞，釋放大量破骨細(xì)胞核因子κB受體活化基因，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化及成熟，強(qiáng)化破骨活動(dòng)[2]。Toll樣受體 4（TLR4）是參與機(jī)體非特異性免疫調(diào)節(jié)的重要蛋白分子，是機(jī)體抵御感染的重要屏障，TLR4與其結(jié)合可上調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）表達(dá)，激活免疫反應(yīng)基因，促進(jìn)炎性因子、粘附因子及趨化因子釋放，直接影響成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞與淋巴細(xì)胞病理過(guò)程[3]。Jiang等[4]發(fā)現(xiàn)，LPS可介導(dǎo)TLR4傳遞信號(hào)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起NF-κB活化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞自主遺傳特點(diǎn)改變，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增生、侵襲及轉(zhuǎn)移。但對(duì)LPS介導(dǎo)TLR4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)成骨細(xì)胞的影響，尚未見(jiàn)報(bào)道。為探討LPS介導(dǎo)TLR4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)成骨細(xì)胞活性和凋亡的影響，本研究以小鼠成骨細(xì)胞為研究對(duì)象，旨在明確LPS介導(dǎo)TLR4/NF-κB通路轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響，為感染所致骨折不愈合提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑與儀器 小鼠前體成骨細(xì)胞株C3T3-E1（北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心），胎牛血清、DEME/F12培養(yǎng)基、α-MEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），噻唑藍(lán)（MTT）、胰蛋白酶、LPS、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Sigma公司），Trizol Reagent試劑（美國(guó)invitrogen公司），流式檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD公司），RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司），DNA引物設(shè)計(jì)及合成（美國(guó)Bid-Rad公司），GAPDH（北京Sinobio公司）；CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司），倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-BAD公司），F(xiàn)ACS Calibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），PTC-150 PCR 儀（美國(guó) MJ.Research Inc.），全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀（美國(guó)Bid-Rad公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 小鼠前體成骨細(xì)胞株MC3T3-E1接種于含10%胎牛血清+1%青-鏈霉素的DEME/F12的96孔板內(nèi)，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)，每3 d換液1次。當(dāng)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞融合＞80%時(shí)，按1∶2比例進(jìn)行傳代。取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組與LPS組，對(duì)照組不予LPS刺激，LPS組待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)50%～60%時(shí)，添加 10 mmol/L LPS，分別再培養(yǎng) 4、8、12、24 h。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取上述兩組培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞于倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.4 TLR4/NF-κB mRNA檢測(cè) 采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）法測(cè)定 TLR4/NF-κB mRNA表達(dá)，收集 LPS 組培養(yǎng) 4、8、12、24 h（對(duì)照組僅取24 h）的細(xì)胞，加入Trizol試劑裂解，提取總RNA，紫外分光光度計(jì)鑒定RNA純度與濃度，反應(yīng)體系：目的基因上下游引物各1.0 μl+內(nèi)參引物上下游引物各 1.0 μl+cDNA 1.0 μl+MgCl2 10 μl+dNTP 5 μl+雙蒸水 8.0 μl。反轉(zhuǎn)錄條件：50 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，95℃ 5 min。反應(yīng)條件：預(yù)變性50℃ 30 min，94℃2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，30 次循環(huán)，72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物置于1.5%瓊脂糖凝膠，染色后采用電泳凝膠成像分析儀及配套分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)算目的條帶基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5 成骨細(xì)胞活性測(cè)定 采用MTT比色法測(cè)定MC3T3-E1細(xì)胞活性。將對(duì)照組與LPS組成骨細(xì)胞放于 DEME/F12培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng) 24 h，加入 20 μl 5 mg/ml的MTT，37℃培養(yǎng)4 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，移除上清，加入100 μl二甲基亞砜，搖床震蕩10 min，溶解結(jié)晶，培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)，氣泡溶解后，采用全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀（570 nm波長(zhǎng)）測(cè)定各孔吸光度值，每孔測(cè)定3次，取均值，以A570值表示細(xì)胞活性。

1.6 成骨細(xì)胞凋亡測(cè)定 采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡測(cè)定試劑盒測(cè)定細(xì)胞凋亡率，將照組與LPS組培養(yǎng)不同時(shí)間細(xì)胞均以2000 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，將細(xì)胞懸液以1×105/ml濃度接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)，1 d后收集細(xì)胞， 加入 5 μl Annexin V-FTTC 及 10 μl碘化丙啶（PI）Staining Solutio，混勻，避 光 、室溫反 應(yīng) 10～15 min，在1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀（EX=488 nm，Em=530 nm）測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，兩組組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，多組比較進(jìn)行方差分析，組內(nèi)比較行LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS對(duì)成骨細(xì)胞形態(tài)的影響 對(duì)照組培養(yǎng)24 h后，鏡下見(jiàn)細(xì)胞呈多角形，邊界清晰，排列緊密，細(xì)胞密度正常（圖1）；LPS組經(jīng)LPS刺激24 h后，細(xì)胞數(shù)目降低，細(xì)胞活力下降，細(xì)胞質(zhì)收縮，細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞密度降低（圖2）。

圖1 對(duì)照組培養(yǎng)24 h后細(xì)胞形態(tài)

圖2 LPS組LPS刺激24 h后細(xì)胞形態(tài)

2.2 兩組TLR4和NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

LPS組培養(yǎng)不同時(shí)間時(shí)，其 TLR4和 NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組（P＜0.05），且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，TLR4和NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸增多（P＜ 0.05，表 1）。

表1 兩組TLR4和NF-κBmRNA相對(duì)表達(dá)量比較(n=3)

2.3 兩組成骨細(xì)胞活性及凋亡率比較 LPS組培養(yǎng)4～24 h時(shí)，其成骨細(xì)胞活性均低于對(duì)照組，細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組（P＜0.05），且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，LPS組成骨細(xì)胞活性逐漸降低，而細(xì)胞凋亡率逐漸升高（P＜0.05表2）。

表2 兩組成骨細(xì)胞活性及凋亡率比較(n=3)

3 討論

一般開(kāi)放性骨折患者常伴細(xì)菌感染，而細(xì)菌感染則為引起骨折延遲愈合或不愈合的重要原因[5]。骨折愈合系成骨細(xì)胞形成骨質(zhì)并發(fā)生鈣化的過(guò)程，而細(xì)菌感染則可能引起局部炎癥因子釋放，導(dǎo)致免疫紊亂，引起成骨細(xì)胞凋亡，造成骨折愈合困難[6]。LPS為細(xì)菌內(nèi)毒素關(guān)鍵成分，包含非特異性多糖、特異性多糖及類脂A，而類脂A則為關(guān)鍵毒性成分，可引起多種器官損傷或衰竭。魏玉香等[7]研究發(fā)現(xiàn)，LPS是細(xì)菌主要致熱源，可降低成骨細(xì)胞活性，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。但對(duì)LPS引起炎癥反應(yīng)的機(jī)制尚未明確。炎癥反應(yīng)為機(jī)體對(duì)外界損傷的正常防御機(jī)制，但骨折后大量炎癥因子釋放可能導(dǎo)致成骨細(xì)胞無(wú)法成骨，破骨細(xì)胞活化，影響骨折愈合。研究報(bào)道，炎癥所引起骨折不愈合主要與LPS引起活化因子配基表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分泌破骨細(xì)胞激活因子有關(guān)，導(dǎo)致成骨細(xì)胞活性降低，促進(jìn)其凋亡[8]。但對(duì)LPS介導(dǎo)成骨細(xì)胞信號(hào)傳遞的確切機(jī)制尚未明確。近期有研究者提出，LPS可能通過(guò)引起NF-κB因子活化，影響骨重建通路[9]。

TLR4是參與機(jī)體非特異性免疫的重要蛋白分子，同時(shí)可介導(dǎo)微生物感染所引起的機(jī)體炎癥反應(yīng)，通過(guò)Toll樣信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致NF-κB聚集于Toll受體結(jié)構(gòu)域，并產(chǎn)生磷酸化反應(yīng)，與腫瘤壞死因子相關(guān)受體結(jié)合，激活下游信號(hào)，引起靶基因表達(dá)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[10]。NF-κB則為TLR4信號(hào)通路下游重要介質(zhì)，TLR4激活可引起NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核、靶基因特點(diǎn)序列，促進(jìn)炎癥因子釋放。當(dāng)細(xì)胞所釋放內(nèi)毒素與細(xì)胞外受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，可激活炎癥因子，導(dǎo)致NF-κB因子活化，在諸多感染誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)疾病中均有重要作用[11]。Guijarro-Munoz等[12]發(fā)現(xiàn)，TLR-4是引起肺栓塞、心肌梗死患者全身感染的主要因子。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS作用后，成骨細(xì)胞TLR-4和NF-κB mRNA表達(dá)水平較未加用LPS干擾的對(duì)照組高，同時(shí)隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，TLR-4和NF-κB mRNA水平逐漸增加，呈時(shí)間依賴性特點(diǎn)，表明LPS可介導(dǎo)TLR4/NF-κB信號(hào)通路活化，而該通路活化后，可產(chǎn)生甲基化、磷酸化、乙酰化反應(yīng)，促進(jìn)炎癥因子表達(dá)。

同時(shí)進(jìn)行成骨細(xì)胞活性及凋亡進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LPS干擾不同時(shí)間后，小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞活性逐漸降低，細(xì)胞凋亡率逐漸上升，呈明顯時(shí)間依賴性特點(diǎn)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示LPS是引起小鼠成骨細(xì)胞活性降低，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的主要原因，分析其機(jī)制可能為L(zhǎng)PS可介導(dǎo)TLR4/NF-κB信號(hào)通路活化， 引起 TLR4和 NF-κB mRNA表達(dá)上調(diào)，在細(xì)胞內(nèi)可與TLR4受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合，啟動(dòng)炎癥因子及輔助刺激因子轉(zhuǎn)錄、翻譯，引起炎癥因子表達(dá)上調(diào)，破壞成骨細(xì)胞生成及修復(fù)，引起細(xì)胞凋亡。

綜上所述，LPS可介導(dǎo) TLR4/NF-κB信號(hào)通路活化，促進(jìn)TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)，引起炎癥因子表達(dá)上調(diào)，降低成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，影響骨重建。