生姜提取物抗氧化應(yīng)激的實(shí)驗(yàn)研究

粟 君，馬 萍，羅建勛，賈亞楠，徐 立

氧化應(yīng)激（oxidative stress）是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，引起一系列的氧化反應(yīng)。氧化應(yīng)激是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，并被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素[1]。氧化應(yīng)激與多種人類疾病有關(guān)，如癌癥、帕金森病、阿爾茨海默癥、動脈粥狀硬化、心力衰竭、心肌梗塞等[2]。部分天然植物產(chǎn)物有很好的抗氧化應(yīng)激作用，如生姜中的生姜精油，姜辣素，生姜酮等化學(xué)成分，均具有抗氧化應(yīng)激的作用；酚羥基化合物具有還原性，能夠清除氧自由基[3]。本研究探討了生姜提取物對H2O2誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)氧化應(yīng)激損傷的預(yù)防保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 生姜購買于重慶農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場，產(chǎn)地為重慶，品種為渝姜1號，烘干、粉碎、備用；乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚（重慶鈦新化工有限公司，AR）；CCK-8試劑盒（索萊寶生物科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone公司）；胰蛋白酶、滅活胎牛血清（杭州四季青公司）；HUVEC（上海默賽飛生物科技有限公司）。

KQ700DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XT-100高速多功能粉碎機(jī)（浙江永康市紅太陽機(jī)電有限公司）；R-210/215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士BUCHI公司）；DLSB-10L/20冷卻循環(huán)真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；Lab-1C-50E冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；I Mark酶標(biāo)儀（Bio-Rad）；HERA cell 150 型 CO2培養(yǎng)箱(美國 Thermo公 司)；OptimaL-100XP 型 超 速 離 心 機(jī) （Beck-man）；TS100型倒置生物顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 生姜提取物的制備 采用系統(tǒng)溶劑分離法，由親脂性到親水性或低極性到高極性的次序組成溶劑系統(tǒng)，依次提取分離不同活性組分。將適量生姜粉（40目）加入100%乙醇，浸泡3 h，收集上清液，得到總提取物；再用石油醚、丙酮和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑萃取分離提取液，得到不同的組分。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞，每2～3 d消化傳代1次。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底約80%時(shí)，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞1遍，0.25%胰蛋白酶液消化2～3 min，加少量含血清的新鮮培養(yǎng)液，終止消化。吹打瓶壁細(xì)胞，使之從瓶壁脫離形成單細(xì)胞懸液。在細(xì)胞懸液中加新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基，5%CO2、37℃培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.4 氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞模型的建立 選取對數(shù)生長期的 HUVEC，調(diào)整為 5.0×104個(gè)/ml，接種于 96 孔細(xì)胞板上，200 μl/孔，5%CO2、37 ℃培養(yǎng) 24 h。 分別加入終濃度為 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mmol/L 的 H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，采用CCK-8還原法檢測細(xì)胞存活率。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值，計(jì)算不同濃度H2O2對細(xì)胞增殖的抑制率（%），以細(xì)胞增殖抑制率為50%（IC50）的 H2O2濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的H2O2濃度。

1.5 生姜提取物抗氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 以硫辛酸為陽性對照藥物，將HUVEC隨機(jī)分為陽性對照組（硫辛酸濃度分別為 0.5、1.0、5.0、10.0 μg/ml）和生姜總提取物組(生姜總提取物濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0 mmol/L)。均預(yù)培養(yǎng)24 h后，加入1 mmol/L H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，繼續(xù)孵育4 h后，采用CCK-8還原法檢測細(xì)胞存活率。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以生姜總提取物抗氧化應(yīng)激作用最強(qiáng)濃度，確定生姜提取物各組分的實(shí)驗(yàn)濃度，進(jìn)行抗氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)，方法同上。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用方差分析和兩兩比較t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生姜提取物結(jié)果 得到總提取物和F1～F6共6個(gè)組分。總提取物為具有生姜刺激性氣味的稠膏，棕褐色；F1～F6組分為棕褐色透明液體。

2.2 不同濃度H2O2對HUVEC增殖的抑制作用隨著H2O2濃度的增加，H2O2對HUVEC增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)出濃度依賴性，H2O2誘導(dǎo)HUVEC氧化應(yīng)激損傷的IC50為1 mmol/L。見表1。

2.3 生姜提取物抗氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果 無論是作為陽性對照藥物的硫辛酸，還是生姜總提取物，均隨著給藥濃度的增加，HUVEC增殖率逐漸增強(qiáng)，提示抗H2O2氧化應(yīng)激損傷的所用逐漸增強(qiáng)，并且均呈現(xiàn)出濃度依賴性。見表2。

因?yàn)樯偺崛∥锟寡趸瘧?yīng)激作用最強(qiáng)濃度為10 mmol/L，所以確定生姜提取物各組分的實(shí)驗(yàn)濃度也為10 mmol/L，進(jìn)行抗氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，隨著組分極性的增加，H2O2對HUVEC增殖的抑制作用逐漸降低，細(xì)胞增殖率逐漸增大，以F5組分的抗氧化應(yīng)激活性最高（表3）。

表1 不同濃度H2O2對HUVEC增殖的抑制作用(%)

表2 陽性對照組與生姜總提取物組細(xì)胞增殖率比較

表3 生姜提取物各組分抗氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

氧化應(yīng)激是由自由基在體內(nèi)引起的一種負(fù)面作用，并被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素[4]。氧在細(xì)胞代謝過程中部分還原為活性氧（ROS），在氧化應(yīng)激中，ROS似乎參與了觸發(fā)或維持疾病狀態(tài)[5]。

生姜的主要化學(xué)成分有姜精油、姜辣素和二苯基庚烷類化合物，如4-姜烯酚shogaols和姜酮Zingerone B[6]。二苯基庚烷類化合物有多種藥理活性，如抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞毒活性。何文珊等[7]從生姜中分離出一個(gè)新的二苯基庚烷類化合物，并且證明此化合物有很強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激活性。王麗[8]對母姜與子姜化學(xué)成分分析及其抗氧化活性研究表明，生姜清除DPPH自由基能力強(qiáng)的組分，大部分集中在中等極性偏上部位。

本研究共得到生姜總提取物和F1～F6共6個(gè)組分。總提取物為具有生姜刺激性氣味的稠膏，棕褐色；F1～F6組分為棕褐色透明液體。抗氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，生姜總提取物具有顯著的抗氧化活性，且其抗H2O2氧化應(yīng)激損傷的強(qiáng)度與硫辛酸相同，并且也呈現(xiàn)出濃度依賴性。

在生姜提取物F1～F6共6個(gè)組分中，F(xiàn)1、F2和F3屬于低等極性和中等極性的組分，F(xiàn)4屬于中等偏上極性的組分，F(xiàn)5、F6屬于高等極性的組分。進(jìn)一步分析生姜提取物各組分的抗氧化應(yīng)激活性發(fā)現(xiàn)，隨著組分極性的增加，抗氧化應(yīng)激活性逐漸增大，以F5組分的抗氧化應(yīng)激活性最高。與王麗[8]對生姜抗氧化活性研究結(jié)果相似，即抗氧化應(yīng)激活性最強(qiáng)的組分，屬于中上極性部位。F6組分抗氧化應(yīng)激活性低，可能是由于F6組分屬于各組分提取后剩余部分，所含抗氧化應(yīng)激物質(zhì)較少有關(guān)。

綜上所述，生姜提取物具有較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激作用，可減輕H2O2誘導(dǎo)的HUVEC氧化應(yīng)激損傷；各提取物中，以F5組分的抗氧化應(yīng)激活性最強(qiáng)。