HIF-1α信號通路參與胎盤內皮增生的可能機制

柏 青，黃尤光，李 涓，邢小芳，李順序，黃 晶，王永梅

不明原因復發(fā)性流產(URSA)當前在臨床上比較常見，占反復流產的50%左右[1]。該病是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生≥3次自然流產，且不存在解剖、內分泌、染色體和自身免疫功能異常以及生殖道感染等病因[2-3]。目前其具體的發(fā)病機制還不明確，導致治療效果不佳。胎盤絨毛血管的協(xié)調發(fā)育與妊娠結局顯著相關，多數流產產婦存在絨毛血管發(fā)育異常，表現為絨毛毛細血管數目減少或功能障礙[4-5]?，F代研究表明，胎盤內皮增生過程中，血管機能不全可能是導致流產的原因之一。缺氧對滋養(yǎng)層細胞相關的侵襲和分化過程具有重要的調節(jié)作用，妊娠過程中的胎盤發(fā)生是在相對缺氧的環(huán)境中進行的，推測氧信號調節(jié)通路可能在流產的發(fā)病機制中發(fā)揮一定作用[6-7]。缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)是哺乳動物和人體內的核轉錄因子，在缺氧時，能夠激活缺氧信號通路，使細胞適應缺氧環(huán)境，參與多種與血管形成有關的疾病[8-11]。本研究探討了HIF-1α信號通路參與胎盤內皮增生的可能機制，希望有利于闡述不明原因復發(fā)性流產的發(fā)生機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 （1）觀察組：選擇2014年 2月～2018年2月在醫(yī)院診治的不明原因的反復自然流產產婦78例，納入標準：夫妻雙方染色體檢查正常；近3個月內未使用過甾體類激素；連續(xù)自然流產＞3次，宮頸分泌物檢測支原體、衣原體為陰性；性激素和垂體激素正常；精液常規(guī)檢查無異常。排除標準：生殖器有器質性病變；出現流產癥狀且B超檢查提示孕囊無原始心血箭搏動；孕周≤12 w。（2）對照組：另選擇同期在本院門診行人工流產術產婦78例，納入標準：有至少一次的正常妊娠史，既往無自然流產、死胎、死產及早產等異常孕育史；月經周期28～30 d，月經規(guī)律，量、色均正常；B超檢查提示胚胎發(fā)育正常；無先兆流產癥狀；排除感染及染色體、內分泌、自身免疫異常等疾病。

兩組一般資料比較無顯著差異(P＞0.05，表1)。本研究得到了所有產婦的知情同意，醫(yī)院倫理委員會也批準了此次研究。

1.2 胎盤絨毛標本采集 胎盤娩出后，立即取胎盤母面中央絨毛組織塊約1 cm×1 cm×1 cm，漂洗后，用10%中性福爾馬林溶液固定≥24 h，梯度酒精脫水后石蠟包埋，采用5 μm連續(xù)切片，4℃保存。

1.3 免疫組化實驗 樣本采用常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精至水化，修復抗原。PBS液洗×3次，3%過氧化氫室溫孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性。滴加正常山羊血清室溫孵育10 min，除非特異性染色。滴加濃度為1∶100兔抗人單克隆抗體VEGF、HIF-1α(一抗)，4 ℃過夜。PBS 液洗×3 次，滴加生物素標記山羊抗兔IgG(二抗)，37℃孵育15 min。PBS液洗×3次，滴加辣根酶標記鏈霉素卵白素工作液(酶標鏈親和素)，37℃孵育 15 min。PBS液洗×3次，DAB顯色，蘇木精復染，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。以PBS替代第一抗體作為陰性對照，VEGF、HIF-1α蛋白主要表達于細胞胞漿及胞膜，部分可見細胞核著色，為淺黃至棕色顆粒，每例標本在400倍光鏡下隨意選取10個視野，計數視野中100個細胞中的陽性細胞數，取其平均數求為陽性百分率，積分 0～1 分為(－)；2～3 分為(+)；4～5 分為(++)；＞5分為(+++)，陽性率=[(++)+(+++)]例數/總例數×100%。將切片置于40倍顯微鏡下，確定染色最高血管密度區(qū)域；然后置于200倍顯微鏡下，選擇3個最高血管密度區(qū)進行微血管計數，求其平均值作為該患者的微血管密度(MVD)值。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS22.00統(tǒng)計軟件分析，計量數據以±s表示，計數數據以頻數和百分率表示，組間比較分別行t檢驗或χ2分析；相關分析采用Spearman等級相關分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 VEGF和HIF-1α表達陽性率比較 觀察組VEGF和HIF-1α陽性率都低于對照組(P＜0.05，表2)。

2.2 MVD密度比較 觀察組MVD密度為(27.49±5.19)%，顯著低于對照組(39.58±4.59)%(P＜0.01)。

2.3 相關性分析 觀察組中，Spearman等級相關分析顯示，MVD與VEGF、HIF-1α陽性率呈顯著正相關(P＜0.05)，VEGF與HIF-1α陽性率呈顯著正相關(P＜0.05)。見表3。

表1 兩組一般資料比較(n=78)

表2 兩組VEGF和HIF-1α陽性率比較(n=78,%)

表3 觀察組相關性結果(r,n=78)

3 討論

成功的妊娠取決于良好的胎盤生長和發(fā)育，包括胚胎形成、胎兒發(fā)育及其與母體內適應性改變[12]。胎兒發(fā)育所需的營養(yǎng)全部來自于胎盤，胎盤內皮增生和功能調節(jié)是保證胎兒從母體獲得充足氧氣和營養(yǎng)物質的關鍵，因此，胎盤的形成是妊娠成功的關鍵[13]。相關研究表明，妊娠早期胎盤發(fā)育是在相對缺氧的環(huán)境中，胎盤局部氧感受和信號調節(jié)系統(tǒng)對胎盤內皮增生發(fā)揮重要的調節(jié)作用[14-15]。HIF-1能轉錄活性核蛋白，主要參與調節(jié)氧穩(wěn)態(tài)。VEGF為一種同型二聚體糖蛋白，在血管內皮細胞特異性結合生長因子受體，促進血管的再生，對維持血管的正常形態(tài)和功能有積極作用[16]。

本研究結果顯示，觀察組VEGF和HIF-1α陽性率都低于對照組，Spearman等級相關分析顯示VEGF與HIF-1α陽性率呈顯著正相關，說明不明原因的反復自然流產可能與VEGF與HIF-1α的低表達有關。從機制上分析，HIF-1α可上調VEGF相關的基因轉錄，促進血管增生，適應缺氧[17]。在缺氧時，內皮細胞產生HIF-1α，誘導VEGF和一些糖酵解相關酶的表達，使血管增生，增加供氧、供血和能量，改善缺氧環(huán)境[18-19]。HIF-1α可廣泛參與哺乳動物細胞中缺氧誘導產生的特異應答，調控多種基因的缺氧誘導表達，機體對缺氧產生適應。如果HIF-1α低表達，下游靶基因的調控活性會下降，胎盤增生出現障礙，滋養(yǎng)細胞表型轉換障礙，影響胎盤正常功能的發(fā)揮，HIF-1α調節(jié)VEGF過程出現障礙，胎盤內皮不良增生，影響胚胎著床及早期發(fā)育，從而導致不明原因復發(fā)性流產的發(fā)生。

本研究發(fā)現，觀察組胎盤絨毛組織的MVD密度低于對照組，表明不明原因的反復自然流產可能與胎盤絨毛組織的微血管密度低有關。從機制上分析，胎盤微血管發(fā)育不良及血管密度減少，造成母體與胎兒血氧等物質交換障礙，胎盤發(fā)育受阻而導致流產，表明MVD減少是造成流產的的原因之一[20]。Spearman等級相關分析顯示，觀察組的MVD密度與VEGF、HIF-1α陽性率呈顯著正相關性，提示反復自然流產孕婦胎盤組織MVD密度降低可能是由VEGF、HIF-1α低表達引起的。人體早期的胎盤內皮增生是發(fā)生在一個相對缺氧的環(huán)境中，其增生發(fā)育經歷了一個氧濃度從低到高的梯度變化過程，氧濃度的變化可能是滋養(yǎng)細胞分化及胎盤血管網形成過程中一個重要的調節(jié)因素。氧濃度較低時，滋養(yǎng)細胞開始增殖；氧濃度較高時，分化侵襲表型的滋養(yǎng)細胞，慢慢浸潤到子宮內膜，使血管再生，為胎兒提供發(fā)育所需的營養(yǎng)[21]。本研究表明，絨毛組織中VEGF與HIF-1α的低表達會導致滋養(yǎng)細胞的表型轉換障礙、血管生成受阻、血管密度減少，從而引起血管重鑄障礙，胎盤灌注不足引起流產。

總之，胎盤內皮增生是胚胎發(fā)育的基礎，HIF-1α信號通路可能參與胎盤內皮增生過程，其低表達可能與不明原因復發(fā)性流產有關。