核仁紡綞體相關蛋白1在結腸直腸癌中的表達及臨床病理意義

蔣浩海, 肖 鋒, 顧春燕, 周林森, 高一飛, 穆向明

(1. 江蘇省鹽城市第一人民醫院 普外科, 江蘇 鹽城, 224001;2. 南通大學附屬南通第三醫院 病理科, 江蘇 南通, 226006)

核仁紡綞體相關蛋白1(NuSAP1)是一種微管結合蛋白，主要表達于增殖細胞，其mRNA和蛋白水平在G2/M期到達峰值，此后迅速下降，在紡錘體組裝中發揮重要功能，是保證細胞周期正常進行的重要調控分子[1]。近年來研究[2]發現，許多腫瘤中存在NuSAP1過表達，其表達水平與腫瘤的增殖和侵襲有關。本研究探討NuSAP1在結腸直腸癌中的表達及其與臨床病理參數的相關性，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2011年12月—2015年12月南通大學附屬南通第三醫院經手術切除的結腸直腸癌(CRC)患者標本116例，經患者知情同意，并通過本院倫理委員會批準。組織標本經10%中性福爾馬林液固定、常規組織學處理、石蠟包埋、5 μm厚度組織切片、蘇木精-伊紅(H&E)染色。收集上述樣本中14例癌組織及相應癌旁組織新鮮標本, -80 ℃凍存，本組病例年齡31～89歲，男80例，女36例。

1.2 實時熒光定量PCR檢測

按Trizol(美國Invitrogen公司)說明書抽提組織總RNA, 紫外分光光度儀測定RNA濃度并定量，按逆轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)說明書行逆轉錄反應合成cDNA。NuSAP1、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物由上海英駿生物工程公司合成。NUSAP1: 上游引物5′-TCATTTCCTTTTCTTGCCTCA-3′, 下游引物5′-CCCTCAAGTACAGTGACCTGC-3′。GAPDH: 上游引物5′-CCATTTGCAGTGGCAAAG-3′, 下游引物5′-CACCCCATTTGATGTTAGTG-3′。每個樣本設3個復孔。反應條件為94 ℃下5 min, 94 ℃下45 s, 60 ℃下1 min, 32個循環, 72 ℃下10 min。

1.3 免疫組織化學檢測及結果判定

通過檢查相應的H&E染色切片，選擇CRC代表性組織塊進行免疫組織化學染色，采用Envision二步法，參照試劑盒說明書(上?；蚩萍加邢薰?進行。實驗設陽性和陰性對照。陽性信號定位于細胞核，采用“雙盲”法進行評定。顯微鏡下評估陽性染色細胞的百分比和染色強度。染色強度分級: 0, 無染色; 1, 輕度染色; 2, 中度染色; 3, 強染色。陽性染色細胞的百分比分級為: 1為0～25%, 2為>25%～50%, 3為>50%～75%, 4為>75%～100%。將染色陽性的腫瘤細胞百分比評分乘以染色強度評分，最后的評分0～4分為低表達, 5～12分高表達。

1.4 統計學分析

2 結 果

2.1 NuSAP1 mRNA在CRC組織、癌旁組織中的表達水平

檢測NuSAP1 mRNA在14例CRC組織和癌旁組織中的表達，結果顯示NuSAP1 mRNA在癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.01)。CRC組織中NuSAP1的相對表達量為(1.34±0.44), 而癌旁組織中相對表達量為(0.77±0.26), 差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2 免疫組織化學檢測NuSAP1蛋白在CRC組織中的表達及細胞定位

進一步運用免疫組化法檢測NuSAP1蛋白在116例CRC組織中的表達情況，結果顯示NuSAP1蛋白陽性信號定位于細胞核(圖1)。NuSAP1蛋白在116例CRC組織中低度陽性表達67例，高度陽性表達49例; NuSAP1蛋白在116例CRC癌旁組織中均呈低表達。NuSAP1蛋白在CRC組織中的表達顯著高于癌旁組織(P<0.01)。

2.3 NuSAP1表達與結腸直腸癌臨床病理參數的關系

分析NuSAP1與CRC臨床病理參數的相關性，結果顯示NuSAP1蛋白表達與CRC分化差、淋巴結轉移和TNM分期高呈顯著正相關(P<0.01), 與CRC患者年齡、性別、腫瘤最大徑、部位、Ki-67增殖指數無顯著相關性。見表1。

A: NuSAP1表達于細胞核，顯示中分化腺癌低表達水平(50倍); B: 圖A局部放大，顯示少量癌旁細胞核陽性表達(200倍);C: 圖A局部放大，顯示癌細胞核陽性表達(200倍); D: 顯示NuSAP1在低分化腺癌組織中高表達水平(50倍);E: 圖D局部放大，顯示癌旁組織中少量細胞核陽性(200倍); F: 圖D局部放大，顯示癌組織高表達(200倍)
圖1免疫組化檢測NuSAP1在CRC癌組織和癌旁組織中的表達和定位(Envision二步法)

表1 NuSAP1表達與結腸直腸癌臨床病理參數的相關性

與同一參數另一亞項比較, **P<0.01。

3 討 論

NuSAP1的正常表達對于維持正常細胞周期是很重要的[3], 其高表達會導致微管聚集成束，造成多種細胞的M期阻滯。謝萍等[4]利用NuSAP1基因特異性探針在人類56種正常組織中進行斑點雜交，顯示NuSAP1高表達于胸腺、胎肝、骨髓等免疫組織及造血組織中，而在腦、成人肝、腎等組織中幾乎無表達。Vanden等[5]報道敲除NuSAP1基因會導致小鼠胚胎致死, NuSAP1基因敲除的細胞中紡錘體不能正確組裝而使細胞周期持續停滯于分裂期，最終導致細胞凋亡，表明NuSAP1是保證細胞周期正常進行的重要調控分子。

微序列分析[6]表明與分化良好的纖維型星形細胞瘤相比，分化差、侵襲性強的膠質母細胞瘤組織中的NuSAP1是一個過表達基因。在乳腺癌中, NuSAP1通過調控BRCA1蛋白的表達水平，能夠導致腫瘤的發生和進展[7]。在三陰性乳腺癌中, NuSAP1過表達提示預后差[8]。NuSAP1在肝細胞癌(HCC)中的表達情況也有少量報道, Satow等[9]研究表明，與非癌組織相比，患者HCC組織中也存在NuSAP1 mRNA表達的上調。張猛等[10]、Xie P[11]的研究顯示，在肝細胞癌組織中亦存在NuSAP1 mRNA及蛋白的過表達，并且與腫瘤的侵襲性及早期復發相關。本研究顯示, NuSAP1基因和蛋白在CRC中的表達上調，與癌細胞分化差、淋巴結轉移呈正相關，與NuSAP1在星形細胞瘤和乳腺癌中的數據是相似的，表明NuSAP1可能參與相關腫瘤的分化、侵襲等過程。

在NuSAP1微管結合域存在2個細胞周期蛋白激酶磷酸化位點, NuSAP1磷酸化或去磷酸化狀態在細胞周期過程中受到精確的調控，并且對于細胞周期進程是至關重要的。在有絲分裂早期, NuSAP1被周期蛋白依賴性蛋白激酶1(CDK1)或細胞周期檢定點激酶(ATM)磷酸化，這種磷酸化阻止了NuSAP1與微管的連接，保證了微管結構能夠維持動態變化; 在有絲分裂中期至后期轉換過程中, NuSAP1發生去磷酸化，去磷酸化NuSAP1能促進紡錘體中心區的形成，從而保證正常細胞周期進程[12-16]。細胞周期轉錄相關因子(E2F1)能夠通過結合NuSAP1啟動子而增加NuSAP1表達，進而促進前列腺癌細胞增殖; 過表達視網膜母細胞瘤基因(RB1)或者抑制E2F1表達都能夠引起NuSAP1表達降低。上述結果表明, RB1是NuSAP1上游分子，可以通過RB1/E2F1信號途徑影響NuSAP1表達，進而調控細胞的增殖和侵襲能力[17-21]。

綜上所述, NuSAP1在CRC組織中高表達，可能參與CRC分化、轉移過程。進一步明確NuSAP1在CRC中的作用機制，將有助于認識NuSAP1在CRC中發揮的生物學功能，為臨床尋找新的治療靶點提供思路。