頭頸部神經(jīng)內(nèi)分泌癌中缺氧相關(guān)因子表達及臨床意義

金立

頭頸部內(nèi)分泌癌在臨床中不常見，屬于頭頸部惡性腫瘤，患者在早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移且死亡率比較高，影響患者預(yù)后因素尚不完全清楚，當(dāng)前臨床對其治療還沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，所以，尋找新的療法使頭頸部神經(jīng)內(nèi)分泌癌療效提升就變得非常迫切[1-2]。伴隨著分子生物學(xué)與免疫學(xué)等不斷發(fā)展，多數(shù)學(xué)者一致認(rèn)為腫瘤轉(zhuǎn)移與浸潤為多步驟、多因素發(fā)展進程，而相關(guān)基因表達為其中重要機制之一。頭頸部神經(jīng)內(nèi)分泌癌患者機體內(nèi)腫瘤組織生長較快，能量代謝變強，葡萄糖攝入量明顯增大，同時會造成患者出現(xiàn)腫瘤內(nèi)缺氧微環(huán)境。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(Glut-1)參加到腫瘤細胞能量代謝過程中，相關(guān)研究顯示許多惡性腫瘤內(nèi)Glut-1出現(xiàn)異常表達。另外，研究表明腫瘤細胞在缺氧狀況下基因表達與轉(zhuǎn)錄中HIF-1α都重要影響，在腫瘤組織代謝中，Glut-1是HIF-1α下游基因會受到調(diào)控，并且PI3K和p-AKT所啟動PI3K/AKT信號通路可調(diào)控HIF-1α與Glut-1表達[3-4]。因此，本文通過分析Glut-1與HIF-1α及p-Akt在頭頸部神經(jīng)內(nèi)分泌癌中表達影響，為臨床患者治療提供一些實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2011年6月至2014年6月間在本院接受治療的頭頸部神經(jīng)內(nèi)分泌癌活檢或手術(shù)標(biāo)本66例，其中男性48例，女性18例，平均年齡(60.7±8.4)歲，6例為鼻神經(jīng)內(nèi)分泌癌(左側(cè)鼻腔2例，右側(cè)鼻腔4例)、12例為鼻竇神經(jīng)內(nèi)分泌癌(5例右側(cè)鼻竇，7例左側(cè)鼻竇)、42例為喉神經(jīng)內(nèi)分泌癌(喉聲門下14例，聲門上28例)、6例為口咽神經(jīng)內(nèi)分泌癌(1例左側(cè)扁桃體，5例右側(cè)扁桃體)，其中出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移12例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例。選取同期在本院接受治療60例聲帶息肉患者作為對照組，其中男性34例，女性26例，平均年齡(55.8±8.6)歲。

1.2 主要試劑

兔抗人Glut-1多克隆抗體、鼠抗人HIF-1α單抗、兔抗人p-Akt多克隆抗體及兔抗人PI3K-p85亞單位多克隆抗體(均由上海賽默飛世爾公司生產(chǎn))。

1.3 試驗方法

免疫組織化學(xué)法：標(biāo)本使用10%中性福爾馬林液進行規(guī)定，石蠟包埋后4 μm切片；脫蠟水化并使用PBS緩沖液3次沖洗，高壓高溫下抗原修復(fù)，切片內(nèi)加入3%過氧化氫，孵育15 min將內(nèi)源性過氧化物酶阻斷，分別加入Glut-1抗體、HIF-1α抗體、p-Akt抗體及PI3K-p85抗體，PBS溶液沖洗3～5 min后每個切片加入聚合物增強劑45 μl，PBS溶液沖洗3 min后切片加入酶標(biāo)抗兔或鼠聚合物45 μl，孵育35 min；PBS沖洗后切片加入AEC或者DAB顯色液90 μl，陽性表現(xiàn)為紅色或者棕色；蘇木精復(fù)染，PBS溶液返藍，水洗，最后蘇木精淡染、脫水及封固。

空白對照：PBS代替一抗為陰性對照；陽性對照：紅細胞染色當(dāng)做Glut-1陽性對照；光鏡下，Glut-1抗體胞質(zhì)或者胞核為不同程度棕黃色，p-Akt、PI3K及HIF-α陽性細胞的染色都在細胞質(zhì)與細胞膜上，表現(xiàn)為均勻棕黃色顆粒。切片隨機察看10個高倍視野，每個視野下記錄100個腫瘤細胞。若陽性細胞比率≥25%是陽性，若陽性細胞比率<25%是陰性。患者隨訪3年，隨訪截止2017年6月。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 患者p-Akt、Glut-1、PI3K及HIF-1α表達情況

在頭頸部神經(jīng)內(nèi)分泌癌內(nèi)Glut-1陽性表達率為81.82%(54/66)，聲帶息肉組織其陽性表達率為6.67(4/60)，HIF-1α表達率為54.44%(36/66)，聲帶息肉其表達率為0%，PI3K陽性表達率為45.45%(30/66)，聲帶息肉其表達率為0，p-Akt表達率為36.36%(24/66)，聲帶息肉其表達率為0%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.984、9.387、12.063、11.338，P<0.05)。

2.2 患者生存率狀況單因素分析

66例頭頸部神經(jīng)內(nèi)分泌癌患者3年生存率36.36%，單因素分析顯示是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠處轉(zhuǎn)移患者間生存率對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 患者3年生存率影響因素分析(例，%)

2.3 影響患者生存率Logistic回歸分析

Logistic回歸分析顯示：遠處轉(zhuǎn)移為影響患者生存率獨立危險因素，見表2。

表2 影響患者生存率多因素分析

3 討論

瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移、增殖、生化和分化等需消耗大量的能量，進而使糖酵解量升高，腫瘤細胞生化特征之一為葡萄糖攝取量增大[5-6]。Glut為介導(dǎo)細胞攝取葡萄糖主要載體，當(dāng)前發(fā)現(xiàn)Glut蛋白已有14余種，Glut-1對葡萄糖親和力較高[7]。相關(guān)研究顯示腫瘤細胞對攝取葡萄糖升高和患者機體Glut-1表達升高有緊密聯(lián)系，在腎癌、乳腺癌、甲狀腺癌、肺癌、胃癌、肝癌和直腸癌等腫瘤組織內(nèi)其表達比其他正常組織顯著升高[8-10]。頭頸部神經(jīng)內(nèi)分泌癌同樣有無限轉(zhuǎn)移、增殖、侵襲與生長特性，其發(fā)生與進展也需大量營養(yǎng)與能量，進而對Glut-1表達刺激增大[11-12]。本文研究顯示癌癥患者機體內(nèi)Glut-1陽性表達率是81.82%，和聲帶息肉對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明Glut-1在腫瘤發(fā)生與進展中有重要影響，可當(dāng)做頭頸部神經(jīng)內(nèi)分泌癌檢測標(biāo)志物之一。

HIF-1為HIF-1β亞基于HIF-1α亞基組成異源二聚體，HIF-α亞基為功能性亞基，細胞內(nèi)氧濃度對其表達有調(diào)控作用。缺氧條件下，HIF-1α表達升高，可上調(diào)細胞增殖，將乏氧反應(yīng)性因基因表達激活[13-15]。患者機體內(nèi)腫瘤細胞無限增大會造成細胞供氧不充足，形成癌組織乏氧微環(huán)境，致使機體HIF-1α表達升高。國內(nèi)外相關(guān)研究顯示，在前列腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌等腫瘤內(nèi)HIF-1α都為陽性表達，在癌前病變組織內(nèi)也存在HIF-1，正常組織內(nèi)則沒有表達，本文研究和相關(guān)研究一致。AKT還可稱作蛋白激酶B，是細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑上原癌基因。它作為信號蛋白分子，參加磷脂酞肌醇3激酶的信號傳導(dǎo)中心環(huán)節(jié)。PI3K-AKT信號路徑可控制腫瘤發(fā)生進展內(nèi)細胞的生物學(xué)進展，包含細胞遷移、轉(zhuǎn)錄、調(diào)控細胞周期、翻譯、增殖、代謝、細胞凋亡和新生血管等，PI3K活化可使AKT磷酸化產(chǎn)生p-AKT，p-AKT能將下游色氨酸殘基與絡(luò)氨酸磷酸化，使下游因子激活，進而發(fā)揮加速生成腫瘤血管、抑制細胞凋亡、加速細胞侵襲、增殖、運動與生長等作用[16-18]。本文研究顯示頭頸部神經(jīng)內(nèi)分泌癌患者機體內(nèi)PI3K陽性表達率為45.45%，p-Akt表達率為36.36%和聲帶息肉表達率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明PI3K-AKT信號路徑在患者疾病進展有一定影響。對患者三年生存率研究顯示，僅轉(zhuǎn)移對其生存狀況有顯著影響。

綜上所述，頭頸部神經(jīng)內(nèi)分泌癌患者PI3K、Glut-1、p-Akt及HIF-1α表現(xiàn)為高表達，其生存情況和發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移有聯(lián)系。