黃芩素對乳腺癌肝轉移的影響及作用機制的體內研究

閆婉君 張淑群

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來有發病年輕及發病率上升的趨勢，嚴重威脅著女性的身心健康，轉移是晚期乳腺癌患者死亡的主要原因。黃芩素是一種廣泛使用的中草藥，大量的研究表明黃芩素具有廣譜的抗腫瘤作用。SATB1(special AT rich sequence binding protein1)是一種組織特異性核基質結合蛋白，近幾年研究SATB1在大多數實體腫瘤組織中的含量都有增加,尤其在浸潤性乳腺癌細胞中高表達。大量研究表明，EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition，上皮間質轉化)的發生過程和Wnt/β-catenin信號通路與乳腺癌的遠處轉移特征有著密切的聯系。本實驗旨在探討黃芩素(Baicalein)對人乳腺癌MDA-MB-231細胞肝轉移的影響及相關的作用機制是否與SATB1蛋白，EMT的發生以及Wnt/β-catenin信號通路有關，這將為黃芩素抗腫瘤的研究增添了新的基礎理論依據，為尋找安全有效的抗癌藥物提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

黃芩素購于美國sigma公司,溶于DMSO(美國 Sigma 公司)并避光保存于-20 ℃；羥甲基纖維素鈉購于美國sigma公司；RPMI-1640購于美國hyclone；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自Amresco公司；雙抗購于西安依科生物公司。SATB1單抗、E-cadherin單抗、Snail單抗購于美國Abacom；Wnt1多克隆抗體、β-catenin單抗、Vimentin單抗購于美國Cell Signaling Technology(CST)。山羊抗兔、抗鼠購于康為公司。SP試劑盒、DAB顯色劑購于北京中杉金橋公司。PVDF膜購于Millipore(美國)。

1.2 細胞系和實驗動物

人乳腺癌細胞系MD-MB-231購于American Type Culture Collection(ATCC,USA)。BALB/c雌性小鼠24只，購于西安交通大學動物實驗中心，4～6周齡，體重為16～20 g；裸鼠飼養在SPF級環境下，恒溫22 ℃～25 ℃，恒濕55%～56%，應用水、飼料及實驗用品均經滅菌、消毒處理，實驗室操作嚴格遵守無菌操作原則。

1.3 藥品配制

Baicalein用二甲基亞砜(DMSO)稀釋成100 mmol/L，0.22 μm微孔濾膜過濾，分裝，-20 ℃保存，使用前解凍。羥甲基纖維素鈉用蒸餾水稀釋成0.5%的溶液，4 ℃保存。灌胃前將溶解的黃芩素懸浮于羥甲基纖維素鈉溶液里。

1.4 細胞培養

MDA-MB-231細胞在高糖DMEM培養基(含10%小牛血清及100 U/L青霉素和100 μg/L鏈霉素)，37 ℃，5% CO2飽和濕度培養箱中培養，每2天更換培養液，0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數生長的細胞用于后續試驗。

1.5 建立裸鼠模型與動物分組及給藥

取處于對數生長體外培養的MDA-MB-231高侵襲性乳腺癌細胞，細胞濃度調整至2×106/ml,無菌條件下，每只裸鼠經尾靜脈注射2×105個細胞。每隔一周觀察裸鼠的體重和健康狀況。將裸鼠隨機分為4組：空白對照組；黃芩素實驗組；黃芩素低劑量預防組；高劑量預防組,每組6只。按體重計算裸鼠給藥劑量，對照組、預防組低組和高組于注射細胞次日開始給藥。實驗組于注射細胞1個月后給藥。實驗組100 mg·(kg·d-1)，低劑量預防組50 mg·(kg· d-1)，高劑量預防組100 mg·(kg· d-1)。確定灌胃給藥，1次/d,對照組給予等體積生理鹽水灌飼，連續15天(表1)。接種細胞8周后，將各組裸鼠頸椎脫臼處死，取肝組織，分別稱其質量。將肝組織固定于4%的多聚甲醛，48 h后在解剖顯微鏡下觀察肝組織表面灰白色結節即轉移灶和其數目(經驗豐富的乳腺病理醫師獨立觀察標本)。

表1 藥物干預

注：a為預防組低劑量，b為預防組高劑量。

1.6 H-E染色

石蠟包埋的肝組織蠟塊，切成5 μm厚。經二甲苯脫蠟和各級酒精水化后，蘇木精染色，鹽酸乙醇水化流水沖洗，1%伊紅酒精溶液染色，蒸餾水稍洗，再經過脫水和透明后。中性樹膠封片，進行圖像采集和分析。

1.7 免疫組化法

載玻片經二甲苯脫蠟和各級酒精水化后，檸檬酸抗原修復液進行抗原修復，然后每張載玻片上組織滴加H2O2，37 ℃孵育20 min，滴加試劑A 37 ℃孵育15 min，然后滴加抗體SATB1(1∶100)，Wnt1(1∶200)，β-catenin(1∶100)，E-cadherin(1∶100)，Vimentin(1∶50)和 Snail(1∶80)4 ℃過夜，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃孵育30 min；滴加試劑B，37 ℃孵育15 min；滴加試劑C，37 ℃孵育15 min；滴加DAB室溫顯色2 min，自來水沖洗3～5 min，蘇木精復染3 min，自來水沖洗10 min，酒精脫水二甲苯透明，中性樹膠封片，應用顯微鏡和圖像采集系統軟件分析。主要檢測各組裸鼠肝組織中SATB1、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin、Snail蛋白表達。判斷指標為：用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。

結果判斷：由經驗豐富的乳腺病理醫師獨立觀察切片。SATB1,Snail蛋白的陽性表達顯示胞質或胞核染為淡黃色至黃棕色為陽性細胞。Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin陽性表達在細胞膜和細胞質中，呈棕黃色顆粒，主要定位于細胞膜和細胞質染為淡黃色至棕色為陽性細胞。表達水平按照半定量法分為3級：-，無表達，染色強度與背景無明顯差別；+,陽性細胞率<50%，染色強度介于兩者之間；++，陽性細胞率>50%,染色強多數細胞呈黃色至棕黃色[1]。

1.8 Western blot

按照RIPA裂解液組提取肝組織蛋白，測定蛋白濃度，加入4×蛋白上樣緩沖液混勻，沸水煮5 min，快速降至室溫后上樣，進行SDS-PAGE電泳。濃縮膠濃度5%，電壓80 V，分離膠濃度10%，電壓120 V。溴酚藍剛跑至凝膠最低端即可終止電泳，轉膜，PVDF膜激活后使用5%的脫脂奶粉或者5%BSA的TBST溶液中室溫封閉2 h后,TBST洗膜一次15 min，孵育一抗SATB1(1∶1 000)，Wnt1(1∶1 000)，β-catenin(1∶1 000)，E-cadherin(1∶1 000)，Vimentin(1∶1 000)，Snail(1∶1 000)，β-actin(1∶1 000)4 ℃過夜，TBST洗膜3次，每次15 min，孵育二抗(1∶5 000)，室溫1 h，TBST洗膜3次，每次15 min。ECL發光液A∶B=1∶1混合，化學發光凝膠成像系統(Syngene 英國)曝光。實驗重復3次。用Image-Pro Plus 6.0軟件凝膠圖象處理系統分析目的條帶光密度值，其比值表示蛋白的相對表達量。

1.9 統計學方法

應用SSPS 18.0軟件進行統計分析。兩組計量資料的比較采用t檢驗，多組計量資料的比較采用單因素方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 肝組織的大體標本和H-E染色

經尾靜脈注射腫瘤細胞后，小鼠體質穩定，狀態良好。4%多聚甲醛固定48 h后肝組織的大體標本，于體視顯微鏡下觀察，發現對照組的肝組織有少量的轉移灶，實驗組和預防組未發現肉眼可見的轉移灶；對照組可見微小轉移灶，在實驗組和預防組未見明顯的微小轉移灶。

2.2 免疫組化結果

SATB1、Wnt1、β-catenin、Vimentin、Snail在對照組肝組織中顯著表達(P<0.05)，在實驗組和預防組中表達降低；E-cadherin在對照組肝組織中表達降低，而在實驗組和預防組表達升高。各抗體的表達抑制率具體結果見表2。各組經統計學檢驗(P<0.05)，差異具有統計學意義。

2.3 Western blot 結果

結果分析(圖1)肝組織SATB1、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin、Snail蛋白的表達水平，膠片掃描儀采集圖片。Image-Pro Plus 6.0測量蛋白條帶灰度值，并分別以SATB1、Wnt1、β-catenin、E-cadherin、Vimentin、Snail的目的條帶與內參β-actin條帶灰度值得比值作為蛋白的相對表達量(表3)。結果顯示實驗組與對照組；預防組低劑量和預防組高劑量SATB1,Wnt1,β-catenin,E-cadherin,Vimentin,Snail各蛋白表達水平與對照組比較均有顯著性差異，其中實驗組和預防組中SATB1,Wnt1,β-catenin,E-cadherin,Vimentin,Snail蛋白表達水平與對照組相比降低，差異有統計學意義(P<0.05)；E-cadherin蛋白表達水平與對照組相比升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 各組蛋白的表達抑制率

注：與對照組相比,a為P<0.05。

表3 各組蛋白的相對表達量/%

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一[2-3]，而轉移是乳腺癌進展的最后階段，同時也是乳腺癌患者高死亡率的主要原因[4]，導致超過90%癌癥患者死亡。正常的乳腺上皮細胞通過一系列連續的變化包括細胞基因和遺傳表觀的改變與微環境的相互作用而發生惡變、侵襲、轉移[5]。目前對于轉移的相關機制尚未完全清楚。尋找有效的毒副作用小的抗腫瘤侵襲轉移藥物，對提高乳腺癌療效、改善預后、提高生存質量，具有重要的理論意義和臨床應用價值。中藥黃芩素是一種廣泛使用的中草藥，研究發現黃芩素在體內外有廣泛的抗腫瘤的作用[6-10]，因此本實驗研究主要在于發現黃芩素抑制乳腺癌細胞肝轉移的影響及相關的作用機制。

國外大量的研究已經表明，SATB1作為“基因組組織者”調控大量轉移相關基因并且在浸潤性乳腺癌高表達和促進肺骨等遠處轉移[11]。Wnt/β-catenin信號通路也參與乳腺癌的遠處轉移。研究發現SATB1調控的轉移相關基因如c-myc和bcl-2同時也被Wnt/β-catenin信號通路所調控，表明Wnt/β-catenin信號通路和SATB1之間有功能上的重疊作用。此外，在乳腺癌中SATB1通過調節β-catenin并與其相互作用，進而β-catenin結合到SATB1的作用靶位點[12]。研究同時也發現其與EMT的發生密切相關。越來越多的證據表明，EMT是許多腫瘤侵襲和轉移早期的一個重要的過程。因此，我們可以假設黃芩素使通過下調SATB1的表達，阻止Wnt/β-catenin的信號通路，從而阻止EMT的發生，進而阻止乳腺癌的轉移的發生。Gao等[12]研究發現黃芩素可顯著降低人乳腺癌MDA-MB-231細胞中SATB1蛋白的表達，且呈濃度依賴性，因此黃芩素可通過抑制SATB1蛋白的表達而發揮抗乳腺癌細胞的侵襲轉移作用。Chung等[13]的研究發現黃芩素在乳腺癌細胞中抑制EMT形成的發生。并且有學者研究也發現上皮的標志物如：E-cadherin 和catenin的減少或者丟失可能與乳腺癌的遠處器官和淋巴結的轉移相關。Matsuda等研究發現Wnt信號通路影響乳腺癌細胞MDA-MB-231的多個生物學性質。Smith等[14]研究發現在浸潤性乳腺癌細胞 (MDA-MB-231)中ERK2通過Snail的同種型激活導致EMT的發生與細胞的遷移增加和黏附減少相關。Vimentin 被稱為EMT的標志物，高表達反應了晚期乳腺癌的高浸潤性和耐藥性。E-cadherin作為上皮的重要標志物，ElMoneim等[15]研究發現浸潤性導管癌患者的病情的進展和預后的重要的特點即E-cadherin的減少。E-cadherin減少可能的機制為與染色質重組，甲基化及改建相關。在浸潤性導管癌和各類乳腺癌細胞中，轉錄水平中CDH1啟動子的甲基化和5 CpG區的重疊被驗證與E-cadherin表達的丟失相關。因其缺乏動物實驗的數據的驗證，只能在體外發揮其作用，因此本實驗通過黃芩素體內實驗的驗證，通過建立乳腺癌裸鼠模型，實驗免疫組化結果為SATB1，Wnt1，β-catenin，Vimentin，Snail蛋白的表達在對照組表達(++/+)，實驗組表達(-/+-)，預防組低劑量(+)和預防組高劑量(+/+-)；E-cadherin在對照組表達(-)，實驗組表達(+)，預防組低劑量(+)預防組高劑量(++)。Western blot 結果為黃芩素下調SATB1，Wnt1，β-catenin，Vimentin，Snail蛋白的表達和上調E-cadherin蛋白的表達。經統計學檢驗P<0.05，各組蛋白表達水平均有顯著的差異。本實驗研究發現黃芩素下調乳腺癌轉移相關蛋白如SATB1，Wnt1,β-catenin,Vimentin,Snail和上調E-cadherin的表達的影響。因此黃芩素抑制乳腺癌的轉移可能機制是通過抑制SATB1蛋白的表達和EMT的發生，阻止Wnt1/β-catenin信號通路，從而減少乳腺癌肝轉移的發生。進一步的驗證還需在其他乳腺癌轉移相關信號通路和基因的水平驗證SATB1、Wnt/β-catenin信號通路和EMT三者相互關系與作用在乳腺癌遠處轉移的研究。本研究設計的不足之處是未設立陽性對照，希望后續實驗設計研究中考慮并進一步的驗證本實驗的結果。

目前的相關研究表明，中藥黃芩素的研究僅停留在基礎研究階段，尚未開展與臨床相關的研究。本研究為黃芩素抗腫瘤轉移的研究和開展臨床試驗增添了新的基礎理論依據，為尋找安全有效的抗癌藥物提供了新的思路。