Sonovue超聲微泡介導DNCREB重組質粒轉染人腎癌786—O細胞的實驗研究

黃帥帥 王雪 姚許平 翁國斌 任雨

[摘要] 目的 本研究旨在探討Sonovue超聲微泡介導DNCREB轉染對人腎癌786-O細胞增殖、凋亡和周期的影響。方法 構建裸鼠腎癌荷瘤模型，將負顯性突變體DNCREB重組質粒結合至Sonovue超聲微泡，經尾靜脈注射后，在體表瘤塊位置給予1 MHz、聲強1 W/cm2靶向超聲輻照，誘導微泡破裂產生空化效應并釋放DNCREB進入靶細胞，觀察并記錄腫瘤大小變化。使用MTT和流式細胞術分別觀察細胞增殖、周期和凋亡情況的變化。 結果 待超聲輻照處理后，相比于Vector組和Control組，DNCREB組細胞增殖能力明顯受抑制、細胞周期發生S期阻滯、細胞凋亡率顯著性增加，同時伴隨著細胞周期蛋白cyclin A和凋亡相關蛋白的Bcl-2表達下調。此外，動物實驗發現：與Vector組或Control組相比，DNCREB組的瘤塊生長能力顯著受抑制。 結論 Sonovue超聲微泡介導DNCREB重組質粒轉染有效地抑制了腎癌細胞的發生發展過程。

[關鍵詞] 超聲微泡；DNCREB；腎癌；增殖；周期；凋亡

[中圖分類號] R737.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）21-0034-04

[Abstract] Objective To investigate the influence of transfection of DNCREB recombinant plasmid mediated by Sonovue ultrasonic microbubble on the proliferation， cycle and apoptosis of human renal cancer 786-O cell. Methods Tumor bearing model of renal cancer in nude mice was established. Recombinant plasmid of negative dominant mutant of DNCREB was combined with Sonovue ultrasonic microbubble. After caudal vein injection， targeted ultrasonic irradiation of 1MHz and sound intensity 1 W/cm2 was given in the tumor location of body surface to induce the microbubble destruction to generate the cavitation effect and release DNCREB into target cells. The size change of tumor was observed and recorded. Results After the ultrasonic irradiation， compared with Vector group and Control group， cell of DNCREB group showed significantly inhibited ability of proliferation， S arrest of cell cycle and significantly increasing apoptosis rate， along with down-regulated expression of cyclin A and apoptosis-related protein Bcl-2. Moreover， animal experiment showed： compared with Vector group and Control group， the growing ability of tumor in DNCREB group was significantly inhibited. Conclusion Transfection of DNCREB recombinant plasmid mediated by Sonovue ultrasonic microbubble inhibited the occurrence and development process of renal cancer cell effectively.

[Key words] Ultrasonic microbubble； DNCREB； Renal cancer； Proliferation； Cycle； Apoptosis

腎癌源于腎小管上皮細胞惡變，其發病率較高并以2%的速度逐年增長，然而其發病機制目前尚不清楚[1，2]。近年來，原癌基因的異常表達與腎癌之間的相關性研究已成為腫瘤病因學研究的熱點。環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）作為調控細胞各種行為的轉錄因子，其Ser-133位點受磷酸化后，能與目的基因的CRE反應元件結合，從而激活靶基因的轉錄過程。已有文獻報道，在多種腫瘤中磷酸化CREB（Phosphated CREB，pCREB）水平呈高表達狀態[3，4]。我們的前期研究也發現，腎癌細胞/組織中pCREB水平顯著性高于正常腎細胞/組織[5，6]。因此，我們欲通過轉染負顯性突變CREB（Dominant negative CREB，DNCREB）抑制腎癌細胞的發生發展。本研究旨在研究超聲微泡介導DNCREB轉染人腎癌786-O細胞后的變化，并深入探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料來源

人腎癌細胞株786-O購自中國科學院細胞庫。RMPI 1640、胎牛血清均購自美國Gbico生物公司；pCREB、CREB、GAPDH兔單克隆抗體及Bcl-2鼠單克隆抗體均購自Cell signaling technology公司；小鼠單克隆Cyclin A、CDK2抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；羊抗兔IgG二抗及羊抗鼠IgG二抗均購自武漢博士德生物公司；細胞周期及凋亡試劑盒均購自杭州聯科生物技術股份有限公司。

1.2 細胞培養

人腎癌細胞株786-O接種于RMPI 1640培養基，培養基中含10%胎牛血清，100 mg/L鏈霉素及1.0×104 IU/L青霉素，培養于37℃、5% CO2飽和濕度的孵箱中。

1.3 DNCREB質粒轉染

在前期實驗中，我們構建了Ser-133位點突變的DNCREB重組質粒[7]。因此，本實驗將細胞分組為：①空白對照組（Control組）；②pCI neo空質粒組（Vector組）；③DNCREB組。轉染過程如下：將6孔板置于超聲探頭上方，探頭上涂少量耦合劑，緊貼6孔板下方。我們預實驗研究表明：當質粒質量為30 μg、造影劑濃度為10%（v/v）、MI指數為0.6、輻照時間5 min時，質粒轉染率最高。待轉染完成后，37℃培養箱繼續培養6 h后更換新鮮培養基，繼續培養24 h。

1.4 Western blot實驗

取對數生長期786-O細胞，以2.0×104個/孔密度接種于6孔板。待超聲微泡介導轉染后，更換完全培養基，待細胞生長48 h，裂解，RIPA法提取總蛋白，BCA法測定蛋白含量，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，4℃冰箱中一抗（1：1000）孵育過夜，TBST清洗3次，相應的二抗（1：5000）孵育1 h，曝光，結果以蛋白相對表達量（目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值）顯示。

1.5 MTT實驗

在25 cm2瓶中培養786-O細胞至對數生長期，按上述分組，待超聲微泡介導轉染后，胰酶消化，接種至96孔培養板，接種密度為2.0×103個/孔，每組設6個復孔，每孔加入100 μL完全培養基，培養24 h。以未處理的培養液孔為陰性對照組。待24 h后，每孔均加入20 μL MTT，37℃培養2 h，492 nm測吸光度值。

1.6 細胞周期實驗

將細胞以1.0×106個/瓶的密度接種于25 cm2細胞瓶中，待細胞融合至50%左右時，超聲法轉染Vector和DNCREB質粒，24 h后胰蛋白酶消化并收集細胞，離心，PBS重懸2次，每個樣品加入PI/RNase染料100 μL混勻，避光孵育15 min，置于流式細胞儀檢測。

1.7 細胞凋亡實驗

待超聲微泡介導質粒轉染人腎癌細胞786-O細胞后，胰酶消化，PI及FITC標記的Annexin V染色10 min，置于流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.8 裸鼠成瘤實驗

注射100 μL濃度為5.0×107個/mL的786-O細胞于4周齡的裸鼠背部皮下，觀察并記錄瘤塊體積變化，體積V=L×W2×π/6（V：體積，L：長度，W：寬度）mm3。

1.9 統計學方法

使用SPSS18.0軟件做統計學處理，計量資料以均值±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩組間比較采用Dunnett-t檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Sonovue微泡介導DNCREB轉染后對786-O細胞增殖能力的影響

Western blot結果顯示：與Vector組相比，DNCREB組中tCREB表達量明顯上調，pCREB水平下調（表1）。此外，MTT實驗結果表明DNCREB組在轉染786-O細胞48 h后增殖能力顯著性下調（圖1）。

2.2 Sonovue微泡介導DNCREB轉染后對786-O細胞周期及相關蛋白的影響

Sonovue微泡處理后，流式細胞術結果表明，與Vector組或Control組相比，DNCREB的S期數量顯著性增加。同時，其細胞周期相關蛋白Cyclin A表達量下調，然而CDK2表達量卻無明顯改變（表2）。

2.3 Sonovue微泡介導DNCREB轉染后對786-O細胞凋亡及相關蛋白的影響

Sonovue微泡處理后，流式細胞術結果表明，Vector組與Control對照組相比，細胞凋亡數量并無顯著性變化，而DNCREB處理后，凋亡數量顯著性上調，伴隨著細胞凋亡相關蛋白Bcl-2的顯著性下調（表3）。

2.4 Sonovue微泡介導DNCREB轉染后對裸鼠皮下成瘤能力的影響

裸鼠成瘤實驗表明，Control組和Vector組在接種8 d后開始出現腫瘤，直至接種5周后，瘤塊體積分別為（206.24±34.47）mm3、（171.42±47.85）mm3，兩組之間瘤塊大小并無顯著性差異。然而，DNCREB組瘤塊體積生長緩慢，生長至2周后體積為（16.83±13.86）mm3，與Control組（55.24±15.31）mm3或Vector（44.42±15.83）mm3相比，出現顯著性差異（圖2）。

3 討論

轉錄因子CREB與腫瘤發生發展密切相關。轉錄因子CREB受cAMP信號激活，從而調控目的基因的表達[8]。有文獻表明，CREB活化與多種腫瘤疾病的不良愈后呈正相關，這也預示著pCREB高表達很可能是腫瘤不良愈后的高危因素[5，9]。本研究利用原癌基因CREB的負顯性突變體DNCREB，證實了pCREB水平的下調可以抑制腎癌細胞增殖、誘導腎癌細胞凋亡和促進細胞周期阻滯等過程。有研究顯示，CREB活化水平受上游激酶如AKT等調控，從而結合下游細胞周期相關基因的CRE序列，進而影響細胞周期進程[10，11]。在Dworet等[12]的研究中，他們發現A-CREB誘導甲狀腺細胞凋亡，并延遲S期進展。另有研究報道，DNCREB能有效抑制DMBA誘導的皮膚乳頭狀瘤塊生長，同時引起cyclin B1和cyclin D1蛋白的表達改變[13]。在我們的實驗中也發現：DNCREB誘導786-O細胞發生S期阻滯，這一結果可能與DNCREB轉染后引起細胞內cyclin A蛋白表達量改變有關。與此同時，我們的研究還發現DNCREB轉染后調控了細胞增殖和凋亡過程。Bcl-2作為腫瘤細胞內原癌基因，能阻止凋亡誘導因子如細胞色素c釋放，從而抑制細胞凋亡[14，15]。我們先前通過生物信息學軟件顯示：Bcl-2基因轉錄起始位點中具有能與CREB結合的CRE位點，因此本研究結果也提示Bcl-2受CREB調控，其改變可能參與調節凋亡誘導因子的釋放，從而介導細胞凋亡過程。

鑒于DNCREB對腎癌細胞的抑制作用，使基因療法成為了可能。然而，傳統的病毒轉染與脂質體轉染方式因其具有安全性低和轉染率差等缺點，限制了DNCREB在靶細胞中發揮作用[16，17]。與傳統基因載體不同，Sonovue微泡造影劑介導的基因轉染克服了這一缺點。Sonovue微泡受到超聲輻照后，可產生連續的壓縮膨脹，使得微泡破裂，伴隨著產生的空化效應致使靶區組織或細胞膜結構通透性增加，促進基因進入靶細胞，這種空化效應在血栓、腫瘤和炎癥組織中已有初步研究[18-20]。Shi等[21]在研究超聲微泡介導Soxp3 siRNA轉染抑制肝癌Treg細胞時，他們發現當微泡濃度為10%、超聲暴露時間為150/180 s、MI指數為1.4時，其基因轉染率達到了50%，Treg細胞活性抑制率最高。我們的預試驗也對超聲轉染參數做了優化，并且在此條件下動物實驗結果顯示DNCREB轉染組裸鼠荷瘤的生長能力顯著受抑制，這個結果也初步證明了Sonovue微泡作為一種無創安全的方式、又能提高DNCREB的轉染效率，更有利于基因靶向治療，也可能成為一種新型的抑制腫瘤發生發展的新方法。

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（收稿日期：2018-02-12）