桑黃素對子宮內膜癌AN3-CA細胞凋亡和侵襲的影響

陳良鳳，王 建， 王雪梅

子宮內膜癌是最常見的婦科惡性腫瘤，全世界范圍內每年約有74 000人死于該病[1-2]。Bokhman[3]將子宮內膜癌分為I型和II型：I型是雌激素相關的子宮內膜癌，與肥胖癥及子宮內膜增生相關，預后較好；II型是雌激素非依賴性的非子宮內膜癌(主要為漿液性和透明細胞癌)，與萎縮性子宮內膜相關，預后較差。盡管多數子宮內膜癌分級低、分期早，預后可；但高級別和晚期的子宮內膜癌病死率高且預后差[4]。目前子宮內膜癌主要采取手術聯合放化療治療，患者的耐受性及預后不理想[5]，故非傳統藥物治療正成為治療無反應或不愿意接受標準藥物治療的子宮內膜癌患者候選方式。

桑黃素是從姜黃植物根中提取的一類具有廣泛抗癌作用潛力的藥劑，因其有抗炎和化療的特性且毒性小，廣泛應用于多種疾病的治療[6-7]。研究證實，桑黃素能選擇性作用于癌細胞而不損傷正常細胞[8]，其抑制腫瘤的潛在機制可能與抑制腫瘤細胞增殖、血管生成及癌細胞的侵襲、轉移、凋亡有關[9]。桑黃素及其類似物對多種腫瘤模型包括膠質母細胞瘤[10]、結腸直腸癌[11]、肺癌[12]、卵巢癌[13]、乳腺癌[14]和口腔癌[15]等均有抑制作用，但對子宮內膜癌的作用少有報道。本研究擬探討桑黃素對子宮內膜癌細胞惡性行為的影響及相關作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗細胞系和試劑：子宮內膜癌細胞AN3-CA由上海細胞生物研究所提供。細胞在含有10%胎牛血清(FBS)，100 mg/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的培養基中培養，在37℃、 5%CO2培養箱中培養，生長至80%左右濃度時進行傳代、凍存和后續的實驗。RPMI-1640培養液、10% 新生小牛血清、含100 u/ml 青霉素和100 μg/ml鏈霉素、0.25% 胰酶溶液購自Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO) 購自Sigma公司。MMP-2、MMP-9及GAPDH一抗購自abcam公司，二抗購自武漢三鷹公司。

1.1.2實驗藥物和試劑：桑黃素購自Sigma公司。將桑黃素溶解于DMSO，濃度分別設定為0、10、20、40 μmol/L。Annexin V-FITC /PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購自上海美季生物技術有限公司。CCK-8試劑盒購自百賽克生物技術有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞活性的測定：使用CCK-8試劑盒測定細胞的活性。將AN3-CA細胞接種在96孔板中，每孔1×104個細胞和100 μl培養基。在37℃、5%CO2的培養箱中孵育24 h。更換新培養基。細胞用分別以0、10、20、40 μmol/L濃度的桑黃素處理24 h和48 h。處理后，將96孔板中的培養基用新鮮培養基替換。然后加入20 μl的CCK-8溶液，并在37℃下孵育4 h。使用酶標儀板在450 nm波長下測量不同組的OD值。實驗重復3次。

1.2.2流式細胞術檢測細胞的凋亡：流式細胞術Annexin V-FITC/PI雙染色被認為是理想的定量測定細胞凋亡的方法。將AN3-CA細胞以2×106的密度接種在6孔板中細胞/孔并生長24 h。然后用不同濃度(0、10、20、40 μmol/L)的桑黃素處理24 h。加入100 μl細胞懸液5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的PI，并將細胞在黑暗中孵育30 min。 PI(5 μl，濃度為10 μg/ml)加入細胞，在黑暗中再次孵育10 min。實驗重復3次。

1.2.3Transwell侵襲實驗：通過Transwell對AN3-CA細胞侵襲能力測定。將AN3-CA細胞在含有0.1%FBS的DMEM中培養24 h后，將在無血清的DMEM中的2×105個饑餓細胞用含有基質膠的小室(直徑6.5 μmol/L，孔徑為8 μm，Corning，NY，USA)接種在上室中，將具有10%FBS的培養基置于下腔中。在37℃下孵育24 h后，小心地去除上膜表面上的細胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%結晶紫溶液染色10 min，自來水沖洗干凈過后，于倒置顯微鏡下計數。實驗重復3次。

1.2.4蛋白免疫印跡檢測：根據蛋白相對分子質量大小，配制凝膠，根據所測蛋白濃度適量加入蛋白樣品及每孔5 μl的蛋白marker。跑膠，首先加壓80 V，保證所有樣品在同一水平線，待樣品至分離膠處，將電壓加到120 V。切膠，根據所需條帶大小，對照蛋白Marker進行切膠，并準備與所切膠條相同大小濾紙2片和PVDF膜(浸泡甲醇15 s)。按照濾紙、膠、PVDF膜、濾紙的順序按序排好，并趕出氣泡，壓緊，在250 mA恒流下，按1 kD蛋白1 min進行轉膜。轉膜結束后，PBST洗膜1次，并放入脫脂奶粉中封閉1 h;一抗，PBST洗膜1次，將膜浸入稀釋好的一抗中，4 ℃過夜；二抗，PBST洗膜3次，將膜浸入稀釋好的二抗中，常溫下孵育1 h；顯影，PBST洗膜3次后，在暗室中曝光并分析。

2 結果

2.1不同濃度桑黃素對子宮內膜癌AN3-CA細胞活性的比較 與對照組比較，當桑黃素作用24 h時，細胞活性分別為100.0%、(71.3±4.2)%、(62.9±3.7)%、(57.5±7.8)%，差異有統計學意義(F=46.62，P<0.05)；當桑黃素作48 h時，細胞活性分別為100.0%、(31.0±6.3)%、(26.1±2.7)%、(18.6±4.4)%，差異有統計學意義(F=257.5，P<0.05)。AN3-CA的細胞活性以時間和劑量依賴性方式減少。見圖1。

2.2不同濃度桑黃素對子宮內膜癌AN3-CA細胞凋亡的比較 當桑黃素作用濃度分別為0、10、20、40 μmol/L時，細胞的凋亡率分別為[(3.9±0.3)%、(9.6±1.0)%、(16.2±0.8)%、(25.8±3.2)%，差異有統計學意義(F=88.68,P<0.05)。AN3-CA細胞的凋亡率以劑量依賴性方式增加，藥物濃度越高，細胞的凋亡率越高。見圖2。

2.3不同濃度桑黃素對子宮內膜癌AN3-CA細胞侵襲的比較 以0、10、20、40 μmol/L濃度的桑黃素處理AN3-CA細胞48 h后，穿過的細胞數量分別為(78.2±7.3)、(59.3±6.5)、(58.7±10.8)、(35.0±5.2)個，差異有統計學意義(F=15.7,P<0.05)，盡管在10、20 μmol/L桑黃素濃度作用細胞時的侵襲細胞數量比較差異無統計學意義，但40 μmol/L時，侵襲細胞數量少于其他濃度組。AN3-CA細胞的侵襲能力以劑量依賴性方式減少，藥物濃度越高，細胞侵襲能力越弱。見圖3。

2.4不同濃度桑黃素對子宮內膜癌AN3-CA細胞表達基質金屬蛋白酶(MMP)MMP-2和MMP-9的比較 不同濃度桑黃素作用后MMP-2的相對表達量分別為1.00、0.73±0.05、0.53±0.12、0.25±0.06，差異有統計學意義(F=49.21，P<0.05)和MMP-9的相對表達量分別為1.00、0.81±0.06、0.48±0.08、0.32±0.12，差異有統計學意義(F=35.09,P<0.05)。在使用桑黃素時MMP-2和MMP-9的表達顯著降低，且呈劑量依賴性方式減少。見圖4。

圖1不同濃度桑黃素對子宮內膜癌AN3-CA細胞活性的影響

圖2不同濃度桑黃素對子宮內膜癌AN3-CA細胞凋亡的影響

圖3 不同濃度桑黃素對子宮內膜癌AN3-CA細胞侵襲的影響

圖4不同濃度桑黃素影響子宮內膜癌AN3-CA細胞表達MMP-2和MMP-9蛋白的影響

3 討論

近年來，子宮內膜癌發病率增高[16]，且其對化療藥物的耐藥性升高，故降低該類患者的病死率及尋找新的治療方式十分重要。目前越來越多的學者將研究重點放在天然產物中提取出的抗腫瘤活性化合物上。桑黃素已被報道顯示等如抗氧化劑、抗炎和抗癌能力多種生物學作用[7]。據報道黃酮類化合物與傳統放化療治療相比，對癌癥的控制效果更明顯[17]。Chun等[18]發現桑黃素與端粒酶抑制劑MST-312聯用可改善癌癥預后。Gupta等[19]認為桑黃素通過抑制信號轉導和轉錄激活因子3，可有效抑制腫瘤細胞生長。文獻報道，桑黃素可通過直接下調肺癌細胞系中miR-135b的表達發揮抗腫瘤功能[20]。本研究通過CCK-8檢測不同濃度桑黃素作用于子宮內膜癌細胞系AN3-CA，結果顯示,隨著桑黃素濃度增加，AN3-CA細胞活性明顯受抑制且隨時間延長抑制作用加強；為進一步探尋桑黃素對AN3-CA細胞凋亡及侵襲的影響，本研究分別使用流式染色及Transwell實驗對桑黃素作用后的AN3-CA進行評估，發現桑黃素作用后AN3-CA細胞凋亡明顯增加，遷移能力明顯減弱；均提示桑黃素對子宮內膜癌存在抑制作用。

MMP-2和MMP-9在癌癥侵襲和轉移的關鍵基膜Ⅳ型膠原降解中發揮重要作用[21]。MMP-9的過度表達可導致腫瘤細胞增殖、遷移，桑黃素能作用于MMP-2和MMP-9，使其表達顯著降低[22]，可能是其抑制腫瘤細胞轉移和及侵襲的關鍵，而桑黃素是否能通過抑制MMP-2和MMP-9表達有效抑制子宮內膜癌的轉移及侵襲尚未可知。本研究結果顯示，在使用桑黃素后，MMP-2和MMP-9的表達顯著降低，且隨著濃度劑量的升高抑制效應越顯著。說明桑黃素可能通過下調MMP-9或MMP-2表達來抑制AN3-CA細胞遷移和侵襲。

綜上所述，桑黃素可明顯抑制子宮內膜癌AN3-CA細胞活性、遷移，并可促進其凋亡，機制可能是通過調節MMP-2及MMP-9的表達來實現。本研究將繼續進行桑黃素作用于臨床子宮內膜癌樣本、動物模型及潛在機制的研究，為子宮內膜癌新治療方式提供有效證據。