白細胞介素-6對人卵巢癌細胞中雌激素受體亞型的調控作用

張桐碩，馬曉霞，宋姜楠，李艷秋，楊 靜，王 越

卵巢癌的病死率位居婦科腫瘤之首，雌激素被公認為是卵巢癌的致病因素之一，雌激素的作用與雌激素受體(ER)不同類型的表達比例有關。目前發現的經典ER包括雌激素受體α(ERα)和雌激素受體β(ERβ)兩大類亞型，同屬于核受體超家族。臨床上以他莫西芬(TAM)為代表性的抗雌激素藥物對卵巢癌的預后改善效果有限，多達50%的ERα陽性卵巢癌始終對TAM不敏感，成為該病輔助性激素治療的一大挑戰。多項研究提示，ERα和ERβ的表達比率可能是影響惡性婦科腫瘤內分泌治療效果的重要因素[1-2]，但卵巢癌ER亞型的上游調控機制及調控因子尚不清楚。白細胞介素-6(IL-6)是卵巢癌炎性分泌網絡的關鍵因子，在卵巢癌細胞的侵襲、轉移等惡性生物學行為中發揮重要作用[3]。臨床資料顯示，卵巢癌患者IL-6的高表達與內分泌治療敏感性差密切相關。我們推測IL-6誘導卵巢癌內分泌治療抵抗的一種潛在機制是調控ER亞型的表達水平。本研究借助生物信息學手段初步分析卵巢癌臨床樣本中IL-6與ER亞型在轉錄水平的相關性，通過體外實驗證明IL-6對卵巢癌細胞ER亞型表達的影響，探討IL-6、ER與卵巢癌耐藥的關系，期待對卵巢癌的預后評價和逆轉內分泌治療耐藥有所幫助。現報告如下。

1 資料與方法

1.1實驗試劑與材料 人卵巢腺癌A2780細胞和人乳突狀卵巢腺癌CAOV-3 細胞均購自美國標準生物品收藏中心(ATCC)，本實驗室保存。重組人IL-6購自美國R&D公司。RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司。胎牛血清購自新西蘭BioInternational公司。TRIzol 試劑購自美國Invitrogen產品。RNA逆轉錄酶購自北京康維世紀生物科技公司。2×Premix Taq由大連寶生物公司提供。100 bp DNA Marker購自北京天根生化科技公司。BCA 蛋白定量試劑盒、化學發光底物檢測試劑盒購自美國Pierce公司。全蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物技術公司。抗ERα單克隆抗體、抗ERβ單克隆抗體購自加拿大Millipore公司。抗β-actin 抗體購自美國Santa Cruz 公司。HRP標記的羊抗兔二抗購自美國 KPL 公司。

1.2穩定轉染細胞株的鑒定與分組 本課題組前期工作證實，對TAM治療敏感的A2780細胞不分泌IL-6但表達其受體，對TAM耐藥的CAOV-3細胞高表達IL-6及其受體，因此選取這兩種細胞模型來研究 IL-6誘導產生的內分泌藥物耐藥機制。本實驗室前期已通過脂質體轉染質粒法成功構建出IL-6過表達或抑制表達卵巢癌細胞模型，用ELISA法分別鑒定出IL-6低、中、高分泌水平的3個A2780細胞克隆和IL-6中、高抑制分泌的2個CAOV-3細胞克隆。同時將轉染空載體的A2780和CAOV-3細胞作為陰性對照。

1.3實驗方法

1.3.1癌癥基因圖譜(TCGA)探索卵巢癌的基因相關性：利用cbioportal 在線軟件(http://www.cbioportal.org/) 收集TCGA數據庫中卵巢癌樣本的mRNA表達(來源于microarray)及其匹配的生存狀態。數據預處理后保留上述資料完整的535例卵巢癌。分別將樣本的IL-6表達與ERα/ERβ表達比率由低到高排序，以中位數劃分為低表達組和高表達組，比較2組的無進展生存期。再分析樣本總體的IL-6與ERα、ERβ基因的相關性。

1.3.2細胞培養及 IL-6 預處理：分別采用濃度為5、25、50 ng/ml的IL-6連續處理A2780 細胞10 d，期間每2 d 更換1次新鮮的培養液并加入相同濃度的IL-6。上述細胞與穩定轉染的IL-6過表達的A2780和IL-6抑制表達的CAOV-3細胞株均用含有100 ml/L胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養液培養。

1.3.3RNA提取及RT-PCR法檢測卵巢癌細胞ER亞型mRNA的表達：抽提RNA按TRIzol試劑說明書進行。PCR反應體系：cDNA 1.0 μl，2×Premix Taq 10 μl，上、下游引物各10 pmol，加雙蒸水至總體積20 μl。PCR 反應條件：94℃ 5 min預變性；94℃ 30 s變性，59℃ 45 s退火，72℃ 1 min 延伸，34 個循環；72℃延伸 10min。檢測所用引物見表1。待PCR反應結束，取產物5μl于12 g/L瓊脂糖凝膠中電泳。結果利用Image J軟件進行分析，以目的基因與內參的灰度比值作為mRNA的相對表達豐度。

1.3.4Western blot 法檢測卵巢癌細胞ER亞型蛋白的表達：取經不同處理的A2780 細胞或CAOV3細胞，以RIPA裂解液提取細胞總蛋白。BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白質量濃度后，在蛋白上清中加入loading buffer煮沸變性。將40 μg/孔的蛋白加入12% SDS-PAGE膠電泳分離。電泳后將蛋白轉印于PVDF濾膜，濾膜用5%脫脂牛奶封閉室溫 1 h后，加入特異性一抗，4℃孵育過夜，再加入HRP標記的二抗室溫孵育1 h。漂洗后化學發光底物檢測試劑盒進行檢測。以目的蛋白與內參的灰度比值作為蛋白的相對表達豐度。

表1 反轉錄聚合鏈反應引物序列

1.4統計學處理 采用SPSS 25.0統計學軟件分析數據。基因表達量的相關性研究采用Spearman相關檢驗，Kaplan-Meier生存分析采用Log-rank檢驗。α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1IL-6和ER亞型基因在卵巢癌樣本的分布及與臨床預后的關系 分析TCGA數據庫的535例卵巢癌標本發現，高表達IL-6者無進展生存率低于低表達者(P<0.05)。見圖1A。同時，高ERα/ERβ表達比率者3年無進展生存率低于低表達比率者(P<0.05)。見圖1B。相關性分析顯示，IL-6基因與ERα基因呈顯著正相關(P<0.01)，見圖2A。而與ERβ基因呈顯著負相關(P<0.01)。見圖2B。

圖1 卵巢癌樣本中不同表達水平IL-6和ERα/ERβ比率的3年無進展生存期曲線圖

圖2 卵巢癌中IL-6基因與ERα、ERβ基因的相關性

2.2從外源性和內源性過表達2種途徑比較IL-6對ER亞型的作用 用外源性IL-6處理A2780 細胞后能明顯上調ERα基因和蛋白的表達，同時能明顯下調ERβ基因和蛋白的表達，且IL-6對ERα的上調和ERβ的下調作用均呈劑量依賴性。見圖3。與A2780細胞空白處理組和空載體轉染組比較，內源性過表達 IL-6的A2780細胞中ERα基因和蛋白的表達明顯提高，同時ERβ基因和蛋白的表達明顯降低，且ER亞型的變化程度隨低、中、高3種IL-6過表達等級依次增大。見圖4。

圖3外源性過表達IL-6對A2780細胞ERα、ERβ表達的影響

A: 不同濃度IL-6處理后ERα、ERβ的mRNA表達水平(RT-PCR)；B: 不同濃度IL-6處理后ERα、ERβ的蛋白表達水平(Western Blot)

圖4內源性過表達IL-6對A2780細胞ERα、ERβ表達的影響

A: 不同濃度IL-6處理后ERα、ERβ的mRNA表達水平(RT-PCR)；B: 不同濃度IL-6 ERα、ERβ的蛋白表達水平(Western Blot)

2.3內源性抑制IL-6表達可下調CAOV-3 細胞ERα及上調其ERβ的表達 與CAOV-3細胞空白處理組和空載體轉染組比較，內源性抑制表達IL-6的CAOV-3細胞中ERα基因和蛋白的表達水平明顯降低，同時ERβ基因和蛋白的表達水平明顯提高，且IL-6 高抑制表達比中抑制表達的ER亞型變化程度更大。見圖5。

圖5內源性抑制表達IL-6對CAOV-3細胞ERα、ERβ表達的影響

A: 不同IL-6抑制表達等級的ERα、ERβ的mRNA表達水平(RT-PCR)；B: 不同IL-6抑制表達等級的ERα、ERβ蛋白表達水平(Western Blot)

3 討論

流行病學研究表明，雌激素暴露與卵巢癌發生的危險性密切相關[4]。以拮抗雌激素為手段的內分泌療法因其靶點精準，不良反應相對較少而成為一種具有吸引力的卵巢癌治療方式；該療法的常用藥物主要有選擇性ER調節劑TAM及芳香化酶抑制劑來曲唑[5]。TAM藥理機制是競爭性地與ER結合來阻斷雌激素的轉錄激活效應[6]。TAM防止對雌激素依賴型乳腺癌的復發、病死率的降低效果顯著[7]，但對卵巢癌的療效欠佳。TAM的耐藥機制錯綜復雜，是當前研究的熱點。ERα是臨床上預測抗雌激素治療敏感性的重要指標[8]，目前90%的回顧性研究支持ERβ高表達能提高抗雌激素療效這一假說[2,9]。ERα與ERβ共同影響內分泌治療的療效，因此研究卵巢癌中ER亞型的調控機制，對臨床的預后及治療意義重大。

正常卵巢組織中ERα、ERβ均有表達且處于平衡狀態，當卵巢發生癌變時，這種平衡將被打破[10]。與乳腺癌和子宮內膜癌相似，ERα被發現是卵巢癌細胞增殖的主要促進因子，而ERβ則抑制卵巢癌的惡性演變[11]，ERα/ER的表達比率常隨細胞癌變而升高，與不良預后表型之間呈正相關[12]。在TCGA數據庫中，隨著ERα/ERβ表達比率升高，卵巢癌患者無進展生存率降低，驗證了這一臨床結論。然而就ERα和ERβ的表達水平是如何改變卵巢癌對內分泌治療敏感性的研究尚不充分。鑒于乳腺癌與卵巢癌在激素敏感性、激素受體的表達水平、對TAM的反應模式等方面存在諸多共性，本研究從乳腺癌TAM耐藥的分子機制獲得啟示。在細胞漿內ER與17-β雌二醇(E2)結合形成二聚體后，從基因組和非基因兩條途徑發揮相應的生物學效應。首先，在基因組調節途徑中，ERα、ERβ入核充當了雌激素調節轉錄因，結合激活蛋白-1(AP-1)增強子元件從而啟動相應靶基因的轉錄[13]。而在AP1位點，ERα與E2結合后該位點表現出轉錄活性，ERβ正好相反，與E2結合后使之喪失轉錄活性。ER-AP1這一模式逆轉了配體的作用，被認為是乳腺癌抗雌激素治療耐藥的機制之一[14]。其次，在非基因組調節途徑中，ER能與負責信號轉導和干擾的蛋白質相互作用，進而參與到信號通路的調節中[15]。MAPK、Hedgehog、PI3K/Akt和mTOR等信號通路的失調是TAM耐藥的一個重要假說[16]。魏麗等[17]實驗結果表明，乳腺癌細胞MCF-7中ERα和ERβ可分別促進和抑制信號通路PI3K/Akt和MAPK信號通路的活化，從而增強和降低細胞對TAM的耐藥性。

炎癥微環境是促進腫瘤進展的重要因素，IL-6作為功能最廣泛的炎性細胞因子之一，與多種雌激素相關腫瘤的生長聯系顯著，IL-6的高表達通常預示著腫瘤患者預后不佳。在TCGA數據庫中，卵巢癌高表達IL-6者比低表達IL-6者的無進展生存率低，與該觀點相符。卵巢癌的不良預后很大程度上可歸因于原發性或獲得性耐藥的產生，與鉑類及紫杉醇類等化療耐藥的機制不同，內分泌耐藥的獲得途徑繞不開ER這一關鍵環節。既往實驗結果顯示[18]，E2能促進卵巢癌細胞分泌IL-6，而ER阻斷劑又可完全抑制該作用，提示雌激素及其受體與IL-6存在著相互間的調控關系。本研究首先從TCGA中的大規模芯片數據得知，在卵巢癌中IL-6基因與ERα基因呈正相關、與ERβ基因呈負相關，由此初步推測，IL-6能上調ERα并下調ERβ的表達。為使結果更具說服力，本研究挑選了兩種細胞株并設置了過表達IL-6和抑制表達IL-6兩個干預方向，最后從正反兩個方向證明了IL-6能促進ERα并抑制ERβ的表達，再聯系ERα和ERβ對TAM耐藥分別起到的增強和逆轉作用，便可解釋IL-6促進TAM耐藥的臨床現象。

本研究以ER亞型的表達水平為研究重點，對IL-6誘導的內分泌治療耐藥機制進行了探索和補充。結合本實驗結果與以上討論的國內外相關研究進展，我們勾勒出IL-6通過調控ER亞型表達誘導TAM耐藥的模式圖，見圖6。

圖6IL-6通過調控ER亞型表達誘導TAM耐藥分子機制

綜上所述，本研究證明了IL-6能促進ERα并抑制ERβ的表達，豐富了對雌激素、ER與 IL-6 之間調控網絡的認識，但其作用還需要進一步驗證。以本研究作為理解IL-6對ER調控作用的切入點，一方面可為利用血清IL-6等體液活檢手段預測卵巢癌患者對抗體激素藥物的反應、指導個體化治療方案提供理論依據；另一方面，提示應用包括IL-6抑制劑在內的多位點聯合靶向治療，可能是未來預防和逆轉卵巢癌內分泌治療耐藥的良好策略。