TLR4信號通路在HBV感染腎小管上皮細胞自噬調控中的作用研究

張曉田，金 李，李慧賢，楊世峰，牛 丹，路萬虹

腎臟損害是慢性乙肝病毒(HBV)感染最常見的并發癥之一，主要表現為乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)和核心抗原(HBcAg)在腎小球、腎小管及腎小動脈血管壁沉積，同時伴隨腎臟炎癥、系膜增生及腎功能損害等病理征象[1]。我國慢性HBV感染人群約有1億人，HBV感染及其并發癥的防治對提高國民生活和醫療水平至關重要，是一個亟待解決的現實問題[2]。目前HBV感染腎損害的病理機制尚未完全明確，細胞自噬是真核細胞利用溶酶體降解受損細胞器和大分子蛋白質，并將其重新納入能量循環的過程。在感染性或炎性疾病中，細胞自噬是一把雙刃劍，適度的自噬對于維持細胞內環境穩定至關重要，過度自噬則可能引起更嚴重的細胞死亡和組織損傷[3-4]。本研究設計體外干預實驗，觀察HBV感染過程中Toll樣受體4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信號通路與腎小管上皮細胞自噬的關系。現報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗細胞 人腎小管上皮細胞系HK-2，購自上海名勁生物科技有限公司。

1.2實驗試劑 TLR4激動劑LPS-PG(上海康朗生物科技有限公司，tlrl-ppglps)，TLR4抑制劑TAK-242(杭州聯科生物，2A-13871-5)；RPMI 1640 培養基(上海浩然生物技術有限公司，12633-012)；胎牛血清(上海浩然生物技術有限公司，16000044)；DAB顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，DA1010)；CCK-8試劑盒(北京碧云天，C0038)；細胞核蛋白與漿蛋白抽泣試劑盒(北京碧云天，P0027)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京碧云天，P0010S)；TLR4、NF-κB、p62、LC-3B、Beclin-1 及β-actin抗體均購自Abcam官網。

1.3實驗儀器 無菌操作臺(蘇州佳寶凈化工程設備有限公司，JB-CJ-1000FX )，細胞培養箱(上海躍進，WJ-3-160q)，低溫高速離心機(德國Eppendorf，Eppendorf 5427 R)，倒置顯微鏡(德國Olympus，CKX53 )，恒溫振蕩器(上海啟步生物科技有限公司，BSW-211C)，垂直電泳及電轉印裝置及其配套耗材(均為美國伯樂原裝，型號Mini-PROTEAN Tetra)，電動勻漿器(美國Kimble，749521-1500)。

1.4細胞培養和干預方法 將人腎小管上皮細胞系HK-2細胞接種于培養瓶進行培養和傳代，采用RPMI 1640 培養基+10%的胎牛血清，培養條件為37℃，5%CO2，當細胞生長至融合至80%左右進行傳代。取2代細胞接種于96孔板繼續培養，設置空白組、HBV感染組、TLR4激動劑組和TLR4抑制劑組。空白組僅培養2代HK-2細胞；HBV感染組加入HBV感染的人血清，所用血清均分離于本科室接收的慢性HBV感染患者；TLR4激動劑組同時加入HBV感染的人血清和10 ng/ml的LPS-PG；TLR4抑制劑組同時加入HBV感染的人血清和10 ng/ml的TAK-242。37℃，5%CO2，培養7 d，繪制細胞生長曲線，并采用CCK-8試劑盒測定HBV感染組、TLR4激動劑組和TLR4抑制劑組的細胞毒性活力。

1.5TLR4信號通路測定方法 細胞培養7 d后進行爬片，采用24孔板和配套的細胞爬片專用玻片進行操作，使用前玻片泡酸過夜，清洗，高壓消毒和烤干。胰酶消化細胞重懸于1640培養基，調整細胞濃度為1×105；24孔板中先放入蓋玻片，再接種細胞，培養48 h，丙酮固定并取出；取出后的蓋玻片可直接蓋于載玻片上，50%甘油封片后即可進行免疫組化實驗。滴加0.3%的過氧化氫(H2O2)孵育30 min，清除內源性H2O2酶活性，PBS清洗5 min×3次，0.5%的Triton X-100孵育20 min，以增加細胞通透性，起到破膜和暴露抗原的目的。一抗孵育，4℃過夜，TLR4與NF-κB的抗體濃度均為1∶500，PBS清洗5 min×3次；二抗孵育，37℃孵育40 min。DAB試劑盒顯色，梯度乙醇脫水之后，封片鏡檢。并采用圖像分析軟件ImagePro Plus 分析陽性表達強度。

1.6細胞自噬測定方法 細胞培養7 d后，棄去培養液，PBS沖洗細胞，并采用蛋白質抽提試劑盒提取總蛋白，進行免疫蛋白印跡(WB)實驗。組裝電泳槽，配置SDS-聚丙烯酰胺凝膠和電泳緩沖液，以每個電泳通道10 μg的蛋白量進行電泳，先以60 V電泳30 min以清除凝膠內雜質，再調至90 V電泳1 h，此時蛋白按照分子量大小依次分割為不同的條帶。組裝電轉印裝置，配置轉印緩沖液，以80 V電轉印30 min，麗春紅染液觀察轉印效果。條帶筆直清晰者進行封閉與抗體孵育，封閉液和抗體稀釋液均以脫脂牛奶配置，封閉液濃度為5%，抗體稀釋液為3%，β-actin、Beclin-1、p62和LC-3B的一抗濃度均為1∶2000，4℃孵育過夜；二抗的濃度分別為1∶2000、1∶1500、1∶2000和1∶1800，37℃孵育90 min。抗體孵育完畢，PBST液清洗，ECL熒光顯色，暗室顯影，拍照，采用圖像分析軟件Image J分析灰度值。

2 結果

2.1細胞生長曲線與毒力活性 各組細胞生長曲線大致呈雙S型，符合細胞生長一般規律。對照組生長速率最快，HBV感染組明顯變慢，TLR4激動劑組最慢，TLR4抑制劑組位于HBV感染組和對照組之間。經CCK-8實驗測得，TLR4激動劑組細胞毒性活力高于HBV感染組和TLR4抑制劑組，且HBV感染組高于TLR4抑制劑組(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組腎小管上皮細胞的生長曲線

2.2TLR4信號通路表達水平 HBV感染組、TLR4激動劑組和TLR4抑制劑組TLR4與NF-κB表達水平均高于對照組(P<0.05)。TLR4激動劑組TLR4與NF-κB表達水平高于HBV感染組，TLR4抑制劑組低于HBV感染組(P<0.05)。見表1。

表1 各組腎小管上皮細胞TLR4信號通路表達水平比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與HBV感染組比較，cP<0.05；與TLR4激動劑組比較，eP<0.05

2.3細胞自噬表達水平 HBV感染組、TLR4激動劑組、TLR4抑制劑組Beclin-1和LC-3B表達水平均高于對照組，P62表達水平均低于對照組(P<0.05)。與HBV感染組比較，TLR4激動劑組Beclin-1 和LC-3B表達水平升高，P62表達水平降低(P<0.05)；TLR4抑制劑組Beclin-1和LC-3B表達水平均降低，P62表達水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組腎小管上皮細胞TLR4信號通路表達水平比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與HBV感染組比較，cP<0.05；與TLR4激動劑組比較，eP<0.05

3 討論

腎損傷是HBV感染的最常見并發癥之一，近幾年來，細胞自噬是其病理機制的研究熱點[5-6]。細胞自噬是指細胞通過溶酶體系統降解受損細胞器和長半衰期蛋白的過程，能被饑餓、創傷應激、病原菌入侵等激活，其目的在于及時清理細胞內雜質，并分解供能，以在惡性環境中維持細胞內環境的穩定。TLRs是機體內的非特異性免疫分子，能快速識別突破機體物理屏障的病原微生物；TLRs還是非特異性免疫和獲得性免疫的橋梁，在識別病原微生物后，能夠通過免疫介質及其信號通路激活細胞免疫[7-8]。TLR4是目前已發現最特殊的TLRs，可識別革蘭氏陽性菌脂多糖及病毒的病原相關分子模式(PAMPs)，因此TLR4及其相關信號通路對細菌與病毒均有免疫調控活性[9]。在心腦血管疾病的基礎與臨床研究中，楊會如等[10]證實啟動TLR4/NF-κB通路能夠激活自噬信號，對抗缺血缺氧性損傷。HBV感染致腎損傷中也有自噬信號異常激活，但是否與TLR4/NF-κB通路有關尚不明確。

本研究采用HBV感染患者的血清感染人腎小管上皮細胞系HK-2細胞，并進行體外培養和TLR4靶向干預實驗，以分析TLR4/NF-κB通路對自噬是否有調控作用。從細胞生長曲線來看，HBV感染后HK-2細胞的生長速率明顯減慢，這主要是因為病毒感染引起了細胞死亡。文獻報道[11]，在HBV感染后，肝臟病理組織同時存在凋亡小體和自噬小體，兩者共同參與了HBV感染的病理進程。本研究結果顯示，TLR4激動劑組細胞生長速率進一步減慢，TLR4抑制劑組的細胞生長速率有所升高，說明抑制TLR4信號對于緩解HBV感染引發的細胞死亡有緩解作用。在所有TLR4相關信號中，TLR4/NF-κB通路是橋接病原微生物免疫、炎性損傷及局部組織壞死的關鍵通路[12]，因此本研究選擇這兩個關鍵介質展開分析，結果證實HBV感染后TLR4/NF-κB信號通路被激活，TLR4和NF-κB表達水平同時上調。

本研究對各組細胞的Beclin-1、LC-3B和P62表達均做了測定，三者在自噬生理病理中具有不同的意義：Beclin-1是細胞自噬的“守門人”，主要介導自噬相關蛋白定位于吞噬泡的過程，以此調節自噬體膜合成和物質轉運，是自噬小體形成與成熟的必需物質[13-14]。LC-3B具有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式，靜息狀態下以前者為主要存在形式，定位于胞質，當自噬流被激活后，LC3-Ⅰ轉化為LC3-Ⅱ并移位于胞膜，同時由于LC3-Ⅱ的分子量較LC3-Ⅰ有所降低，WB實驗可同時看到LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩條條帶，因此多數研究以WB實驗測定LC-3B的表達水平，并以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ作為衡量自噬強度的重要指標[15-16]。真核細胞主要存在兩種蛋白降解系統，泛素蛋白酶體系統和自噬-溶酶體系統，p62是SQSTM1基因編碼的泛素結合蛋白，也稱為SQSTM1蛋白，在細胞自噬和細胞凋亡中均介導重要機制。文獻報道[17]，無論自噬上游還是下游信號被阻斷，都會導致P62聚集，P62表達與自噬強度呈負相關性。本研究發現HBV感染組的Beclin-1 和LC-3B表達水平升高，P62表達水平降低，說明HBV感染激活了腎小管上皮細胞的自噬，這可能是一種自我保護機制。進一步研究發現，激活TLR4/NF-κB信號通路后自噬水平加強，而抑制TLR4/NF-κB信號通路后自噬水平有所減弱，證實通過靶向干預TLR4能夠調控HBV感染腎小管上皮細胞的自噬。

綜上所述，本研究證實TLR4信號通路在腎小管上皮細胞HBV感染過程中可能參與了細胞自噬的調節作用，可能是其病理機制的重要組成部分，具有深入研究的價值。