小鼠子宮內膜干細胞損傷修復調控機制的研究

葉國柳 靳麗杰 王玲玲 周玉

（蚌埠醫學院第一附屬醫院婦產科 安徽 蚌埠 233004）

1.引言

人類子宮內膜是一種高度再生組織，一個生育年齡婦女的子宮內膜要經歷超過400個周期以上的增長，分化，和脫落。子宮內膜炎，子宮內膜結核等婦科疾病以及宮腔手術都可能導致子宮內膜損傷，從而引起繼發性閉經、不孕、習慣性流產等疾病。近年來宮腔鏡的廣泛應用使子宮內膜疾病的診斷及療效更具針對性，但是對于子宮內膜修復障礙的治療方法仍舊十分有限。近年來，國內外的學者從子宮內膜中分離出基質和上皮兩種類型的干細胞，而子宮內膜上皮在月經中脫落后的再生有可能是間充質干細胞增殖分化的結果?？傊?，子宮內膜干細胞的相關研究，為子宮內膜損傷修復的細胞療法提供了理論依據，但對于子宮內膜干細胞分化調控機制需要進一步的研究。

2.材料與方法

2.1 材料

10～14周齡Wistar雌鼠(220～250g），中國醫科大學實驗動物中心提供)20只；40mg/kg 戊巴比妥(Sigma)；SP免疫組織化學超敏試劑盒、DAB顯色劑、多聚賴氨酸（上海生工）；辣根過氧化物酶標記二抗（1∶2000稀釋），羊抗鼠單克隆抗體Wnt-1（1∶100稀釋），兔抗鼠單克隆抗體β-Catenin（1∶200稀釋，碧云天）；PVDF膜（Takara）

2.2 方法

2.2.1 確證Wnt/β-catenin信號通路存在于子宮內膜損傷修復中并起著重要作用 本部分實驗中，應用Wnt/β-catenin信號通路轉基因報告鼠（BAT-gal 小鼠）進行研究，用100°熱水導管損傷小鼠Y型子宮一側宮角，在損傷后6h、8h、7d、14d進行取材制作小鼠子宮內膜損傷模型，與正常小鼠比較通過對子宮內膜進行組織切片及X-gal染色，了解Wnt信號在小鼠子宮內膜的分布和表達的變化。

2.2.2 分離純化小鼠子宮內膜邊緣（SP）群干/祖細胞；觀察它們移植到小鼠損傷子宮內膜后的存活和遷移。

利用MEF作為飼養層培養EGFP+SP細胞，急性損傷后移植一定量未分化的GFP+小鼠邊緣（SP）群干/祖細胞至內膜損傷小鼠宮腔內，14天后取子宮，直接熒光顯微鏡觀察和HE染色后及抗GFP蛋白抗體免疫組化染色后顯微鏡下觀察小鼠邊緣（SP）群干/祖細胞的存活和遷徙情況。

2.2.3 本部分研究旨在了解Wnt-7a和SFRP-2 對小鼠子宮內膜損傷模型中經典Wnt信號通路的關鍵蛋白和下游靶基因的表達水平的影響。

用western blot方法檢測各組小鼠子宮內膜損傷模型β-catenin、GSK3b、Apc、c-myc的表達水平；采用BCA蛋白測定試劑盒對蛋白進行定量，聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后電轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉后加入一抗，4℃搖動過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，加入化學發光劑，X線片顯影、定影，用圖像分析儀測定各條帶的吸光度值作定量分析，同時檢測B一肌動蛋白表達，確保各組蛋白上樣量相等

2.2.4 統計學分析 使用SPSS22.0軟件進行統計分析，Western blotting 灰度值利用ANOVA法中的多重比較判斷組間差異（設定P＜0.05）。

3.結果

3.1 Wnt/β-catenin信號通路轉基因報告鼠（BAT-gal 小鼠）建立小鼠子宮內膜損傷模型；通過特殊的X-gal染色確證Wnt/β-catenin信號通路存在于子宮內膜損傷修復中并起著重要作用。

3.2 通過直接熒光顯微鏡觀察和免疫組化染色后顯微鏡下觀察,證實產后小鼠子宮內膜邊緣（SP）群干/祖細胞分離純化并進行培養后移植到損傷的宮腔內，能在宮腔內存活和遷移并且對損傷內膜組織發揮修復作用

圖2 Wnt-l免疫組織化學檢測結果

3.3 western blot和QPCR等方法檢測來證實Wnt信號通路激動劑Wnt-7a和阻斷劑SFRP-2后Wnt信號通路的調節變化。證實Wnt/β-catenin信號通路在（SP）群干/祖細胞修復損傷子宮內膜中的調節作用。

圖3 Wnt-1與β-catenin蛋白印跡免疫分析

4.討論

子宮內膜干/祖細胞再生人類子宮內膜的能力,已在異種移植模型中被證明。把人子宮內膜上皮和間質單細胞懸液移植到免疫功能嚴重低下，缺乏T，B和NK細胞的NOG小鼠腎包膜下方，產生了包含有子宮內膜和子宮肌層的子宮組織。再生子宮內膜移植到去卵巢NOG小鼠，生成了角蛋白+CD9+腺體結構，CD10+CD13+基質和α-平滑肌細胞（αSMA）陽性的肌樣組織。異種移植的子宮內膜隨著雌激素和孕激素的周期循環而變化，類似人的月經周期。新鮮分離的SP細胞主要構建血管和遷移ERβ，表達血管內皮細胞（80%）。13%基質和8%腺體分別由移植的SP細胞產生。當移植到免疫功能低下小鼠中，克隆的人子宮內膜上皮細胞和間質SP細胞也產生了子宮內膜組織。這些移植產物免疫組化染色顯示基質（波形蛋白+）與上皮（CD9+），但不是內皮細胞（CD31+）。有組織的子宮內膜腺體不容易區分，這可能是由于長期的SP細胞克隆培養。再生的子宮內膜組織沒有表達ER，但一些細胞表達PR。這些研究表明，具有干/祖細胞活性的子宮內膜細胞亞群可以在體內產生子宮內膜組織。這些亞群還可能誘發子宮內膜異位病灶的生長。

小鼠是一個公認的研究子宮內膜功能的動物模型。在人類胎兒期子宮腺體發育，但在嚙齒類動物中腺體發育在出生后，這對于在子宮內膜腺體發育過程中研究子宮內膜干/祖細胞是一個絕對的優勢。幾種小鼠模型已經被建立,用來研究子宮內膜再生和類似月經后的子宮內膜修復。Wnt/β-catenin信號通路是調控細胞生長和增殖的關鍵途徑，激活靶基因。該通路的核心是胞質內β-catenin穩定，當β-catenin水平低下時，Wnt通路關閉；反之，Wnt通路開啟。人類子宮內膜也特征性表達Wnt信號蛋白，并受雌、孕激素調節，參與子宮內膜的發育、分化和胚胎著床等生理過程。

子宮內膜損傷后干細胞的修復和因損傷或其他嚴重疾病而切除組織或器官的干細胞替代是眾多婦產科及干細胞研究者關注的焦點。目前已經證實成人干細胞存在于子宮內膜并且它們可以在體內重建內膜組織，以及Wnt信號相關分子在子宮內膜生長中起著重要作用等。本研究項目利用Wnt/β-catenin信號通路轉基因報告鼠（BAT-gal小鼠）建立子宮內膜損傷模型，了解Wnt信號分布和表達的變化；并把分離純化小鼠子宮內膜邊緣群干/祖細胞移植到損傷的小鼠子宮中,通過對經典Wnt信號通路的干涉，觀察其對子宮內膜損傷后修復的影響，探討Wnt信號在子宮內膜干細胞修復中的作用，為子宮內膜損傷修復障礙及其引發疾病的干細胞治療方法提供新的研究思路。