瀘州地區醫院環境中產超廣譜β-內酰胺酶大腸桿菌耐藥基因研究

孫 瑞，何 丹，郝 雯，孫 秀，廖婉琳，周英順

(西南醫科大學基礎醫學院病原生物學教研室，四川瀘州 646000)

細菌對抗菌藥物的耐藥問題日益嚴重，其耐藥水平及程度越來越高，已經成為全球關注的公共衛生問題[1-2]。產抗生素水解酶是導致細菌耐藥的主要原因[3]。而β-內酰胺酶是細菌產生的可水解青霉素類及頭孢類等多種抗生素的蛋白，尤其是產超光譜β-內酰胺酶（extended spectyum-β-lactamase，ESBLs）的細菌給臨床感染的診治造成嚴重挑戰[4]。中國細菌耐藥監測網數據顯示，產超廣譜β-內酰胺酶大腸桿菌仍然是臨床分離最高菌株（http://www.carss.cn/），產β-內酰胺酶大腸桿菌嚴重威脅到臨床感染的診[5]。研究發現，醫院環境（污水、洗手間、門把手、醫療廢棄物）中耐藥菌可加速耐藥菌院內感染，同時也促進了耐藥菌的播散，加重了臨床感染治療的負擔[6-7]。因此開展醫院環境大腸桿菌及耐藥性的監測及監控，對院內感染的防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑及標準菌株

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、麥康凱瓊脂，LB固體培養基、LB營養瓊脂、M-H肉湯培養基等購自北京索萊寶科技有限公司；DNA 聚合酶 Ex Taq、Premix TaqTM、dNTP Mixture、DNA Marker、均購自TakaRa大連寶生物有限公司；瓊脂糖、核酸染料購自英濰捷基；引物合成及測序由上海生工技術有限公司完成。藥敏紙片購自溫州康泰生物技術有限公司。大腸桿菌標準菌株ATCC25922由西南醫科大學病原生物學教研室保存。

1.2 標本采集及細菌分離鑒定

無菌棉簽采集四川省瀘州地區六家醫院的環境樣品包括病房地板、電梯按鈕、衛生間水龍頭、病房門把手、換藥室、垃圾桶、空氣等標本200份，均勻涂抹在麥康凱瓊脂平板，37℃過夜培養后，挑紅色單菌落于液體TSB培養基震蕩培養12 h，使用16s RNA通用引物27F和1429R PCR擴增16s RNA基因，電泳檢測PCR產物，并將PCR產物送上海生工有限責任公司進行序列測定。所獲序列通過GenBank、Ez-Taxon6和LeBIBI數據庫鑒定菌種種屬關系。

1.3 藥敏表型測定

對通過16s RNA序列測定比對確定為大腸桿菌菌株進行ESBLs確證實驗，方法參照美國臨床實驗室委員會（CLSI-M100-S17）標準進行。對ESBLs為陽性的菌株進行氯霉素、四環素、環丙沙星、諾氟沙星、頭孢噻呋、氨芐西林、磺胺甲氧嘧啶、阿米卡星等抗生素藥敏實驗。按照美國臨床實驗室委員會標（CLSI）推薦的K-B紙片法進行。將所分離大腸桿菌培養至對數生長期，生理鹽水稀釋到OD值為0.08～0.1之間，使用滅菌棉拭子蘸取菌液均勻涂布于TSA培養基,將所選擇的藥敏紙片等距地貼在瓊脂平板表面。37℃過夜培養，游標卡尺測量抑菌圈大小并按照標準進行結果判定。大腸桿菌ATCC25922作為陰性對照。

1.4 細菌耐藥基因檢測

挑ESBLs陽性菌株單菌落于TSB肉湯培養基震蕩過夜培養。參考分子克隆手冊采用煮沸法制備DNA模板。使用PCR方法擴增磺胺類耐藥基因（sul1，sul2，sul3），氯霉素耐藥基因（cat，floR,cmlA,cfr），氟喹諾酮（qnrA,qnrB,qnrC,qnrD）類，氨基糖苷類耐藥基因[（rmtA,rmtB,rmtC,rmtD,aac(6')-Ib,ant(3')-Ia）]，主要的ESBLs基因（blaCTX-M-1,blaCTX-M-2,blaC-TX-M-9,blaSHV,blaTEM），四環素耐藥基因（tetA,tetB,tetC），頭孢菌素耐藥基因（blaCMY和blaDHA）及主要整合子類型（Int1與Int2）進行檢測，并對其進行序列測定。引物（表1）由上海生工合成，所獲產物送上海生工進行序列測定[8]。

表1 所擴增耐藥基因引物序列

b l a CTX-M-1[1 2]b l a CTX-M-2[1 2]b l a CTX-M-9[1 2]b l a SHV [1 2]b l a TEM [1 2]b l a CMY [1 3]b l a DHA [1 3]R m t A [1 4]R m t B [1 4]R m t C [1 4]a a c(6')-I b [1 5]a n t(3')-I a [1 5]t e t A [1 5]t e t B [1 6]t e t C [1 5]I n t 1[1 7]I n t 2[1 7]I n 1[1 7]I n 2 F:G G T T A A A A A A T C A C T G C G T C R:T T G G T G A C G A T T T T A G C C G C F:A T G A T G A C T C A G A G C A T T C G R:T G G G T T A C G A T T T T C G C C G C F:A T G G T G A C A A A G A G A G T G C A R:C C C T T C G G C G A T G A T T C T C F:A T T T G T C G C T T C T T T A C T C G C R:T T T A T G G C G T T A C C T T T G A C C F:A T G A G T A T T C A A C A T T T C C G T G R:T T A C C A A T G C T T A A T C A G T G A G F:T G G C C A G A A C T G A C A G G C A A A R:T T T C T C C T G A A C G T G G C T G G C F:A A C T T T C A C A G G T G T G C T G G G T R:C C G T A C G C A T A C T G G C T T T G C F:C C C G T G A G A T T G T T G C T G R:T G T C T G G T C T T G C G T T T C F:T T T C T G C G G G C G A T G T A A R:A G T T C T G T T C C G A T G G T C T T T F:G A A G A A G T A A C A G C C A A A G R:A T G C C A G C C T C C G T A A A F:A T G A C C T T G C G A T G C T C T A T G R:C G A A T G C C T G G C G T G T T T F:A T C T G G C T A T C T T G C T G A C A R:T A T G A C G G G C T G A T A C T G G F:G G C A C C G A A T G C G T A T G A T R:A A G C G A G C G G G T T G A G A G F:T T G G T T A G G G G C A A G T T T T G R:G T A A T G G G C C A A T A A C A C C G F:C T G G G C T G C T T C C T A A T G C R:A G C T G T C C C T G A T G G T C G T F:T C T C G G G T A A C A T C A A G G 2 4 3 R:G T T C T T C T A C G G C A A G G T F:C A C G G A T A T G C G A C A A A A A G G T 2 3 3 R:G T A G C A A A C G A G T G A C G A A A T G F:A A G C A G A C T T G A C C T G A R:G G C A T C C A A G C A A G F:C G G G A T C C C G G A C G G C A T G C A C G A T T T G T A R:G A T G C C A T C G C A A G T A C G A G[1 7]

2 結果

2.1 菌株分離鑒定及藥敏結果

從瀘州地區6家醫院所采取的200份標本中，分離到大腸桿菌51株，通過藥敏表型和ESBLs確證實驗，其中24株為ESBLs陽性菌株。24株菌對氯霉素、四環素和磺胺類耐藥率為100%，對氟喹諾酮類耐藥率為87.5%，對氨基糖苷類耐藥率為54.1%。

2.2 藥敏試驗結果及超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)大腸桿菌耐藥基因檢測

耐藥基因詳細結果見表2，發現這24株ESBLs陽性菌，其中blaCTX-M陽性率為19/24（圖1），對其序列測定分析發現其中blaCTX-M-14陽性率為6/24，blaC-TX-M-15陽性率為5/24，blaCTX-M-27陽性率為3/24，blaCTX-M-3陽性率為4/24，blaCTX-M-24陽性率為1/24，blaSHV陽性率為17/24，其中 blaSHV-11陽性率為 3/24，blaSHV-12陽性率為7/24，blaSHV-38陽性率為2/24，blaSHV-2a陽性率為3/24，blaSHV-28陽性率為 1/24，blaSHV-26陽性率為 1/24。blaTEM-1陽性率為7/24，頭孢菌素耐藥基因blaDHA與blaCMY陽性率分別為3/24和1/24。磺胺類耐藥基因（sul1與sul2）陽性率分別為11/24和3/24，四環素耐藥基因（tetA與tetB）陽性率分別為10/24與1/24。氯霉素耐藥基因（floR，cmlA）陽性率分別為5/24與3/24。氟喹諾酮類耐藥基因（qnrB，qnrS）陽性率為9/24，2/24。氨基糖苷類耐藥基因（rmtA，rmtB，aac(6')-Ib,ant(3')-Ia）陽性率分別為1/24、2/24、6/24、1/24。詳細結果見表2，本研究中檢測出1型整合子10個，其中有一個菌同時攜帶I型和II型整合子。其中dfrA17-aadA5和dfrA12-orfF-aadA2結構基因盒菌株均為4株，含有dfrA1-orfC，dfrA1-sat2-aadA1和dfrA17基因盒菌株。

圖1 19個blaCTX-M耐藥基因電泳圖

3 討 論

多重耐藥大腸桿菌分離率依然高居不下,給臨床細菌性疾病感染的診治造成嚴重挑戰（http://www.carss.cn/）[18]。研究表明，醫院環境（空氣、污水、門把手等）中存在著大量的耐藥菌，也可導致院內感染，促進了耐藥基因的播散，給耐藥的防治帶來嚴重挑戰。本研究從瀘州地區6家醫院環境中分離到51株大腸桿菌，其中ESBLs陽性菌為24株，其對氯霉素、四環素和磺胺類耐藥率為100%，對氟喹諾酮類耐藥率為87.5%，對氨基糖苷類耐藥率為54.1%。表明醫院環境中ESBLs大腸桿菌陽性率較高，且對其他抗生素耐藥率較高，說明需要加強對醫院環境中細菌耐藥性的監測和監控[6-7]。本研究發現，24株產ESBLs大腸桿菌中，ESBLs耐藥基因blaCTX-M和blaSHV陽性率分別為19/24和17/24，且存在著多種亞型，如本研究發現blaCTX-M陽性率為19/24，其中主要存在著blaCTX-M-14，blaCTX-M-15，blaCTX-M-27，blaCTX-M-3，blaCTX-M-24等五種 亞 型 ，同 時 存 在 著 blaSHV-11，blaSHV-12，blaSHV-38，blaSHV-2a，blaSHV-28，blaSHV-26。表明醫院環境中 ESBLs基因類型存在多樣性，需警惕新亞型的出現。24株ESBLs陽性菌，除了攜帶有ESBLs基因，同時攜帶有其他抗生素水解基因，如磺胺類、氯霉素、四環素、氨基糖苷類及氟喹諾酮類抗生素耐藥基因。表明24株ESBLs菌均為多重耐藥菌。此外，從24株ESBLs陽性菌中檢測出I型整合子有10個，且存在同時攜帶I型和II型整合子的菌株。整合子菌株基因結構以dfrA17-aadA5和dfrA12-orfF-aadA2為主。整合子是耐藥菌株水平傳播的重要方式，可能促進了耐藥基因的傳播。

4 結 論

瀘州地區醫院環境中產ESBLs大腸桿菌耐藥水平較高，主要攜帶有blaCTX-M-14和blaSHV12等ESBLs耐藥基因，且存在著多種亞型，同時攜帶有耐四環素、氯霉素、氨基糖苷類及氟喹諾酮類耐藥基因。因此，需警惕醫院環境中耐藥菌傳播。