RCAS1基因與乳腺癌相關性分析

覃新干,黨裔武,韋康來,劉金祿,張小彬

（1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胃腸腺體外科,廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科，廣西 南寧 530021）

乳腺癌是目前威脅女性健康的主要因素，根據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，全球女性新發(fā)乳腺癌病例數(shù)和乳腺癌死亡病例數(shù)均位居各類癌癥的首位。我國乳腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，發(fā)病高峰在45～60歲，有年輕化的趨勢[1]。近年來，我國乳腺癌發(fā)病率的增長速度是全球的2倍多，特別在城市地區(qū)，像大多數(shù)其他國家一樣，乳腺癌是我國女性最常見的癌癥[2]。研究乳腺癌的發(fā)生及預防乳腺癌的發(fā)生更顯為重要和迫切。隨著腫瘤發(fā)病機制研究的深入，研究者越來越意識到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是腫瘤細胞與宿主之間相互對抗和博弈的過程，宿主細胞與腫瘤之間的相互作用對腫瘤的進展、轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)歸具有關鍵的影響，而宿主的免疫系統(tǒng)和其形成的免疫微環(huán)境在腫瘤進展和轉(zhuǎn)移中起至關重要的作用。SiSo細胞上的受體結合腫瘤抗原（receptor-binding cancer antigen expressed on SiSo cells，RCAS1）是一種新的腫瘤相關抗原，具有促進腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視，影響癌組織間質(zhì)微環(huán)境的作用[3]。那么，RCAS1與乳腺癌的發(fā)生是否有關系呢？本文通過免疫組化檢測RCAS1基因在乳腺癌組織的表達情況，初步探討其與乳腺癌發(fā)生的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2013年1月～2015年10月在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院住院并手術治療的105例乳腺癌患者的癌組織、癌旁組織及年齡、腫瘤大小、病理組織學分級、淋巴結等臨床病理資料。所有患者術前均無化療、放療及免疫治療等，病理學診斷均為浸潤性導管癌。全部為女性患者，年齡24～81歲。標本均經(jīng)10%中性甲醛固定、石蠟包埋、常規(guī)切片、HE染色后病理學檢查確定。

1.2 主要試劑 RCAS1抗體購自美國SANTA CRUZ生物技術有限公司，SupervisionTM鼠、兔通用二抗檢測系統(tǒng)購自上海長島生物科技有限公司。

1.3 方法 免疫組化染色參照抗體說明書操作，4疫組常規(guī)石蠟組織切片65℃烘烤2 h，二甲苯脫蠟，梯度酒精至水。將切片浸入預熱至沸騰的檸檬酸鈉修復液中，繼續(xù)加熱至高壓鍋閥門上汽后計時2.5 min，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS浸洗3洗3 min。滴加50加n性過氧化物抗體（1:100），37℃濕盒中孵育90 min，PBS充分浸洗3 min。滴加SupervisionTM鼠/兔通用二抗檢測系統(tǒng)室溫孵育25 min，PBS充分浸洗3 min。DAB顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察和分析。選用已知陽性的乳腺癌標本作為陽性對照，用PBS液代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定 RCAS1陽性表達細胞為細胞漿或膜著色，呈棕黃色。每例切片隨機選取至少5個高倍視野（×高倍視野），計數(shù)至少500個細胞，評分參照免疫反應積分法。染色強度分為4級：不顯色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。陽性細胞百分率分為4級，陰性為0分，≤25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分。兩分級相加，0～3分為陰性表達，≥4分為陽性表達。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 RCAS1蛋白表達情況 RCAS1陽性表達在細胞為細胞漿或膜著色，呈棕黃色。RCAS1在乳腺癌組織、癌旁組織的表達率分別為84%（88/105）、17%（18/105），差異有統(tǒng)計學意義。

表1 RCAS1蛋白在乳腺癌組織及癌旁組織表達情況Table 1 Expression of RCAS1 protein in breast cancer tissue and paracancerous tissue

2.2 RCAS1蛋白的表達與乳腺癌臨床病理特征關系 在乳腺癌組織中，RCAS1蛋白的表達在以患者的年齡、腫瘤大小、病理組織學分級、淋巴結轉(zhuǎn)移等方面比較，差異無統(tǒng)計學意義。

表2 RCAS1蛋白的表達與乳腺癌臨床病理特征關系Table 2 Relationship between expression of RCAS1 protein and clinicopathological features of breast cancer

3 討論

腫瘤細胞為實現(xiàn)其對宿主的免疫逃逸，主要通過修飾腫瘤細胞本身和改變腫瘤微環(huán)境以逃逸宿主免疫細胞的識別和攻擊。而腫瘤一旦發(fā)生其細胞的自身特點就決定其逃逸能力。腫瘤微環(huán)境由腫瘤細胞外基質(zhì)、腫瘤浸潤免疫細胞以及細胞因子等組成，是機體免疫系統(tǒng)與腫瘤細胞進行博弈的場所，因而，腫瘤微環(huán)境上的機體免疫細胞識別與攻擊腫瘤細胞的強弱在很大程度上決定了腫瘤細胞能否成功實現(xiàn)免疫逃逸。

人RCAS1/EBAG9基因即SiSo細胞上/雌激素受體結合片段相關基因9表達的受體結合腫瘤抗原，定位于人類染色體8q23.2，是一種雌激素轉(zhuǎn)錄蛋白。RCAS1蛋白是通過其C末端卷曲螺旋結構形成同型寡聚體的Ⅱ型膜蛋白，在多種人類癌細胞上有表達，如子宮、卵巢、前列腺癌、肝細胞癌、肺癌細胞等。研究表明，RCAS1蛋白作為存在于各種人類細胞中的推定受體的配體，包括正常的外周淋巴細胞，如T，B和天然殺傷（NK）細胞，不僅存在于腫瘤細胞中，而且還存在于正常組織的細胞中，并且控制免疫應答。在體外和體內(nèi)RCAS1蛋白抑制受體表達的細胞生長，并通過caspase-3的活化和線粒體跨膜電位的崩解誘導凋亡的細胞死亡，RCAS1蛋白可能通過抑制T淋巴細胞生長又促進其凋亡而在腫瘤細胞免疫逃逸中發(fā)揮作用，如RCAS1誘導活化的TILs凋亡而使腫瘤細胞逃避宿主的免疫監(jiān)視。RCAS1蛋白的高表達與腫瘤進展和多種癌癥患者的不良預后顯著相關[4-8]。

本文采用免疫組化檢查發(fā)現(xiàn)RCAS1蛋白在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達率分別為84%（88/105）、17%（18/105），與Suzuki T等在乳腺浸潤性導管癌中，用免疫組化等方法研究發(fā)現(xiàn)RCAS1表達陽性率為90.1%（82/91）相似[9]。乳腺癌組織與癌旁組織中RCAS1蛋白的表達有差異，差異有統(tǒng)計學意義。同時，我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中，RCAS1蛋白的表達在以病人的年齡、腫瘤大小、病理組織學分級、淋巴結轉(zhuǎn)移等方面作為比較，差異無統(tǒng)計學意義。RCAS1基因在乳腺癌組織中高表達，癌旁組織中呈低表達，而這種高表達在以年齡、腫瘤大小、病理組織學分級及淋巴結轉(zhuǎn)移與否等方面作為比較的癌組織中表達沒有差異，提示RCAS1基因表達可能與乳腺癌發(fā)生密切相關，與年齡、腫瘤大小、病理組織學分級、淋巴結轉(zhuǎn)移等方面關系不密切，這可能是RCAS1蛋白可能通過抑制T淋巴細胞生長又促進其凋亡而在腫瘤細胞免疫逃逸中發(fā)揮作用有關。文獻報道，RCAS1蛋白質(zhì)參與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境及其免疫反應，使腫瘤細胞實現(xiàn)免疫逃逸[10]。

本文采用免疫組織化學方法檢測105例乳腺浸潤性導管癌組織及相應癌旁組織的RCAS1基因表達，發(fā)現(xiàn)RCAS1基因與乳腺浸潤性導管癌密切相關，值得進一步研究。