IL-6、IL-6R基因多態性與特發性肺動脈高壓發病的關系

段智慧，張燦花

(內蒙古醫科大學附屬醫院，呼和浩特 010050)

特發性肺動脈高壓(IPAH)屬于臨床上少見的致命性疾病，發病率較低，一般表現為肺動脈高壓升高以及動脈壁增厚，病情嚴重者發展為右心衰竭[1]。以往研究認為缺氧是IPAH形成的重要原因，近期研究顯示IPAH初期已存在炎性細胞浸潤，其中白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-6受體(IL-6R)水平升高可促進IPAH的發生發展[2,3]。大量研究[4]顯示，單核苷酸多態性(SNP)與IPAH發生、病情嚴重程度密切有關,而IL-6、IL-6R基因多態性與IPAH發病風險是否相關目前尚無研究。本研究觀察了IL-6、IL-6R基因多態性與IPAH發生風險的相關性，為早期預防IPAH提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年2月～2017年10月內蒙古醫科大學附屬醫院收治的IPAH患者97例(觀察組)，男58例，女39例；年齡(61.35±10.44)歲。納入標準：①患者均符合肺動脈高壓世界論壇頒布的IPAH診斷標準[5]，右心導管檢測，平均肺動脈壓超過25 mmHg，且毛細血管契壓<15 mmHg；②患者間無血緣關系；③均為漢族；④知悉本研究并簽署知情同意書，本研究獲得本院倫理委員會批準同意。排除標準：①冠狀動脈粥樣硬化、心力衰竭、門靜脈高壓；②肺結核、肺栓塞、間質性肺??；③惡性腫瘤以及自身免疫疾??；④肝、腎功能嚴重受損；⑤近期服用阿米雷司等藥物。另選同期在本院體檢的健康者80例(對照組)，男49例，女31例；年齡(59.85±9.56)歲。兩組一般資料無統計學差異，具有可比性。

1.2 IL-6、IL-6R基因rs8192284位點多態性檢測 ①血液樣本收集：所有入選對象均在清晨空腹狀態下采集靜脈血3 mL，加入抗凝管內，以2 000 r/min離心3 min，加入紅細胞裂解液混勻后，以3 000 r/min離心30 s，保存血清，放置-80 ℃進行保存。②基因組DNA提取及兩對引物-聚合酶鏈式反應(PCR-CTPP)檢測：采用DNA提取試劑盒提取全血基因組DNA，檢測其純度和濃度，OD260/280為1.8～2.0，可用于后續研究。DNA樣本稀釋到50 μg/L，采用Sequenom軟件進行SNP基因分型，IL-6、IL-6R基因rs8192284位點PCR擴增、單堿基延伸引物均由廣州Invitrogen公司合成；PCR反應體系共50 μL，Taq Buffer 5 μL，MgCl23 μL，位點T、G(A、C)引物上下游各2 μL，dNTP Mix 1 μL，DNA樣本4 μL，Taq DNA 0.5 μL，H2O 28.5 μL。IL-6基因rs1800796位點PCR反應程序設定：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性，30 s；60 ℃退火，30 s；72 ℃延伸，60 s；40個循環；72 ℃延伸10 min。IL-6R基因rs819228位點的PCR反應程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性20 s，53 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。取PCR產物2 μL，在瓊脂糖凝膠中進行電泳，至于凝膠成像系統觀察電泳條帶，回收PCR產物，經上海生工生物公司進行序列測定。③結果判定：根據電泳條帶，確定IL-6、IL-6R基因多態性。IL-6基因rs1800796位點：1.野生型純合子CC型，兩條DNA條帶，279 bp、179 bp；2.突變雜合子CG型，三條DNA條帶，279 bp、179 bp、100 bp；3.突變純合子GG型，一條DNA條帶，279 bp。IL-6R基因rs819228位點：1.野生型純合子AA型，兩條DNA條帶，258 bp、188 bp；2.突變雜合子AC型，三條DNA條帶，258 bp、188 bp、70 bp；3.突變純合子CC型，一條DNA條帶，258 bp。

2 結果

2.1 PCR-CTPP反應產物電泳及基因型判定 IL-6在rs1800796位點存在單核苷酸多態性，分別為野生型純合子CC型、突變雜合子CG型、突變純合子GG型；IL-6R在rs8192284位點存在單核苷酸多態性，分別為野生型純合子AA型、突變雜合子AC型、突變純合子CC型;測序驗證準確率為100%。

2.2 Hardy-weinberg遺傳平衡驗證 觀察組和對照組IL-6、IL-6R基因型頻率實際值與預測值比較均無統計學意義(P均>0.05)，IL-6、IL-6R基因型頻率穩定，符合Hardy-weinberg平衡定律。

2.3 兩組IL-6基因rs1800796位點基因型及等位基因頻率比較 結果見表1。

2.4 兩組IL-6R基因rs8192284位點基因型頻率及等位基因頻率比較 結果見表2。由表2可知，兩組IL-6R基因rs8192284位點基因型頻率及等位基因頻率比較均無統計學差異(P均>0.05)。

表1 兩組IL-6基因rs1800796位點基因型及等位基因頻率比較

注：與對照比較，*P<0.05。

表2 兩組IL-6R基因rs8192284位點基因型及等位基因頻率比較

2.5 IL-6基因多態性與IPAH發生風險的相關性 結果見表3。由表3可知，突變雜合基因型CG以及純合的GG基因型可增加IPAH的發病風險，為IPAH發生的危險基因型。

表3 IL-6基因多態性與IPAH發生風險的Logistic回歸分析

2.6 IL-6基因與IPAH患者臨床病理參數的關系 觀察組CC型、CG+GG型平均肺動脈壓分別為(60.05±11.12)、(65.07±9.11)mmHg，心指數分別為(2.12±0.38)、(2.36±0.42)L/(min·m2)，肺血管阻力分別為(24.95±4.37)、(27.85±3.68)WU·m2，兩者比較，P均<0.05。觀察組CC型年齡(61.50±11.38)歲，男23例、女17例，心功能分級Ⅱ級12例、Ⅲ級6例、Ⅳ級3例，肺毛細血管契壓(9.03±1.15)mmHg，心輸出量(3.75±0.53)mL；CG+GG型年齡(61.23±9.64)歲，男35例、女23例，心功能分級Ⅱ級43例、Ⅲ級20例、Ⅳ級13例，肺毛細血管契壓(9.07±1.11)mmHg，心輸出量(3.86±0.66)mL；兩者比較，P均>0.05。

3 討論

IPAH是以肺血管阻力升高為主要特征的血管功能紊亂病癥，其發病原因不明，患者預后較差[6]。Hoffmann等[7]對194例IPAH患者預后進行分析，顯示患者平均生存期不足3 a。目前臨床上無根治IPAH的有效方法，探究IPAH的病因及發病機制是預防、治療IPAH的重要途徑。近年來，IPAH分子遺傳學研究成為熱點，一些炎癥因子基因的多態性能通過影響基因轉錄、表達進而影響炎癥因子活性，從而決定不同個體對IPAH的易感性[8]，因此基因多態性可能是決定個體IPAH易感性差異的分子基礎。

人體IL-6基因位于染色體7P15-21位置，該基因多態性位點主要位于啟動子區域中的rs1800796G/C、-597G/A，其中rs1800796位于啟動子-572(572 C→G)位。IL-6基因多態性可影響IL-6基因的轉錄和表達，影響IL-6的表達水平，進而影響相關疾病的發生發展與臨床表現[9,10]。研究[11]顯示，IL-6基因rs1800796位點的多態性與血清IL-6水平相關，位點C→G突變與血清IL-6水平變化相關。Chang等[12]發現，rs1800796位點C→G突變者尿蛋白水平明顯高于未突變者，患者發生糖尿病腎病的風險也明顯升高。謝軍等[13]認為，rs1800796GG基因型突變是胃癌發生的風險因素。目前，在IPAH中未見該基因位點多態性有關報道。本研究顯示，IPAH患者IL-6基因rs1800796位點存在多態性，CC型基因較常見，與北京等地有關報道相接近[14]；且觀察組中GG基因型頻率明顯高于對照組，提示IL-6基因rs1800796位點多態性可能與IPAH有關。Logistic分析發現，IL-6基因rs1800796位點突變雜合基因型CG、突變純合基因型GG與野生純合基因型CC比較差異顯著，表明突變雜合基因型CG以及純合的GG基因型可增加IPAH的發病風險，推測IL-6基因rs1800796位點C→G突變為IPAH發生的危險基因型。而研究證實，rs1800796位點C→G突變會降低IL-6啟動子轉錄活性，降低患者血清IL-6水平，進而降低膿毒癥發生風險，這與本研究結果中C→G突變增加疾病發生風險不符合，分析可能為研究病例受到地理位置、生活環境、種族或實驗設計的影響，導致結果出現差異。

IL-6基因rs1800796位點C→G突變可能會對患者臨床表現產生一定的影響。有研究顯示，IL-6基因rs1800796位點C→G突變會使血清中CRP水平發生變化，進而影響患者臨床表現[15]。IPAH最顯著的臨床特征就是肺動脈壓和肺血管阻力持續升高[16]。本研究通過對臨床病理參數分析，顯示IL-6基因rs1800796位點G基因攜帶者的平均肺動脈壓、心指數、肺血管阻力明顯高于CC基因者，表明IL-6基因rs1800796位點C→G突變會促進肺動脈壓、肺血管阻力心指數升高，加重病情，心指數增加可能會發心衰。

IL-6R位于人染色體lq21區，其中rs8192284位點位于外顯子區域，其A→C突變后引發Ala氨基酸被替代，而該位點位于分子穿模區域，能夠改變IL-6R蛋白構象，進而使IL-6R以溶蛋白裂解形式將IL-6R釋放至血清中，使血清IL-6R水平升高[17]。目前，對于IL-6R基因rs8192284位點的多態性是否為疾病發生的危險因素尚存在爭議。研究[18]顯示，IL-6R基因rs8192284位點A→C突變與T2DM易感性降低有關。但也有文獻[19]報道認為A→C突變后與患者單純肥胖相關，而與T2DM的發生無關。而文獻[20]報道，IL-6R基因rs8192284位點A→C突變者雜合子攜帶者出現黑素瘤的風險明顯高于純合子攜帶者。目前，尚未有文獻報道IL-6R基因rs8192284位點基因多態性與IPAH發生的有關性。本研究顯示，兩組IL-6R基因rs8192284位點基因型頻率及等位基因分布無明顯差異，提示IL-6R基因rs8192284位點基因多態性與IPAH的發生無關，分析原因可能為IPAH疾病發病原因較復雜，可能與各因素互相作用有關，也可能與病例種族以及研究時基因分型技術有關。

總之，IL-6基因rs1800796位點多態性可能是IPAH發生的一個危險因素，該基因位點GG、CG基因型可增加IPAH的發病風險，但具體機制還有待后續深入研究。